羅氏診斷二代測(cè)序技術(shù)在HBV耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用

1、羅氏診斷二代測(cè)序技術(shù)羅氏診斷二代測(cè)序技術(shù)在在HBVHBV耐藥檢測(cè)耐藥檢測(cè)中的中的應(yīng)應(yīng)用用 羅氏診斷羅氏診斷 應(yīng)用科學(xué)應(yīng)用科學(xué)市場(chǎng)部市場(chǎng)部 劉璐璐劉璐璐HBV HBV 耐藥性產(chǎn)生耐藥性產(chǎn)生 病毒每天高速復(fù)制，并在復(fù)制時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤，這些自發(fā)突變導(dǎo)致突變株出現(xiàn)。 突變株增殖能力通常低于野生型，因而在未用藥的群體中占少數(shù)。 但在病毒藥物作用下，藥物對(duì)于耐藥性的突變有選擇作用，導(dǎo)致了耐藥菌株成為優(yōu)勢(shì)株，導(dǎo)致藥物治療的失敗。 耐藥是核苷酸類藥物的共性耐藥是核苷酸類藥物的共性耐藥檢測(cè)的意義耐藥檢測(cè)的意義治療前檢測(cè)，有助于臨床判斷用治療前檢測(cè)，有助于臨床判斷用藥是否有效；藥是否有效；治療中每治療中每 36個(gè)月檢

2、測(cè)，有助于個(gè)月檢測(cè)，有助于觀察療效，及時(shí)調(diào)整用藥觀察療效，及時(shí)調(diào)整用藥EASL Clinical Practice Guidelines：Management of chronic hepatitis B. European Association for the Study of the Liver. J Hepatol, 2009, 50: 227-242.用藥后出現(xiàn)耐藥用藥后出現(xiàn)耐藥拉米夫定拉米夫定 阿德福韋酯阿德福韋酯 恩替卡韋恩替卡韋 替比夫定替比夫定 替諾福韋替諾福韋測(cè)序用于病毒耐藥檢測(cè)測(cè)序用于病毒耐藥檢測(cè)深度測(cè)序可檢出低頻準(zhǔn)種深度測(cè)序可檢出低頻準(zhǔn)種超深焦磷酸測(cè)序可檢測(cè)低于1%的準(zhǔn)

3、種普通焦磷酸測(cè)序僅限5%及以上的準(zhǔn)種毛細(xì)管電泳測(cè)序僅限20%及以上的準(zhǔn)種提早判斷準(zhǔn)種組成，在劣勢(shì)菌種未發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)菌種之前，即調(diào)整用藥策略；降低治療失敗可能性，減少對(duì)身體傷害。454454高深度測(cè)序優(yōu)勢(shì)高深度測(cè)序優(yōu)勢(shì)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)對(duì)于RTRT基因區(qū)段基因區(qū)段1%1%突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，比目前常用的一代測(cè)序及線性探針反向雜交法更加靈敏更加靈敏進(jìn)行相對(duì)定量定量，對(duì)于病毒群體中突變數(shù)量改變進(jìn)行跟蹤深度測(cè)序的運(yùn)用將較傳統(tǒng)方法提前提前3-63-6個(gè)月檢測(cè)出突變個(gè)月檢測(cè)出突變，因此能夠更好的抓住治療的時(shí)機(jī)并給出治療的方案454454測(cè)序系統(tǒng)發(fā)展測(cè)序系統(tǒng)發(fā)展測(cè)序通量及讀長不斷增加，大小測(cè)序平臺(tái)齊備

4、GS 20 GS 20 GS FLX Standard GS FLX Standard20 Mb20 Mb100 Mb100 Mb200520052007200720082008FutureFutureEven Longer ReadsEven Longer ReadsHigher DensityHigher DensityLaterLater GS FLX Titanium GS FLX Titanium500 Mb500 MbGS Junior TitaniumGS Junior Titanium GS GS FLX+FLX+20112011獨(dú)立獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室適用型實(shí)驗(yàn)室適用型精巧精巧型型 二

5、代測(cè)序平臺(tái)二代測(cè)序平臺(tái) GS JuniorGS JuniorGS Junior GS Junior 測(cè)序步驟概覽測(cè)序步驟概覽Mix ssDNA & capture beads 454 454 測(cè)序流程測(cè)序流程 文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建1. 4541. 454文庫構(gòu)建：文庫構(gòu)建：Shotgun Shotgun Paired-endPaired-end300bp1Kb, 3Kb, 300bp1Kb, 3Kb, 8Kb, 20Kb8Kb, 20Kb* *PCRPCR產(chǎn)物可直接測(cè)序產(chǎn)物可直接測(cè)序傳統(tǒng)文庫構(gòu)建：傳統(tǒng)文庫構(gòu)建：BACBAC克隆克隆-Shotgun/PCR-Shotgun/PCR一個(gè)片段一個(gè)

6、片段 = = 一個(gè)反應(yīng)珠一個(gè)反應(yīng)珠 454 454 測(cè)序流程測(cè)序流程 emPCR2. emPCR2. emPCR每個(gè)每個(gè)DNADNA分子分子獨(dú)立獨(dú)立進(jìn)行進(jìn)行PCRPCR反應(yīng)后反應(yīng)后獨(dú)立獨(dú)立測(cè)序測(cè)序擴(kuò)增效果好，適應(yīng)高擴(kuò)增效果好，適應(yīng)高GCGC含量片段、甚至含量片段、甚至FFPEFFPE樣本樣本一個(gè)反應(yīng)珠一個(gè)反應(yīng)珠 = 一個(gè)讀長一個(gè)讀長 單克隆測(cè)序的價(jià)值單克隆測(cè)序的價(jià)值通過通過 emPCRemPCR實(shí)現(xiàn)單克隆實(shí)現(xiàn)單克隆直接閱讀每一種分子結(jié)果直接閱讀每一種分子結(jié)果突變比例的計(jì)算（低頻）基于實(shí)際的序列信息突變比例的計(jì)算（低頻）基于實(shí)際的序列信息每個(gè)每個(gè)DNADNA分子分子獨(dú)立獨(dú)立進(jìn)行進(jìn)行PCRPCR反

7、應(yīng)后反應(yīng)后獨(dú)立獨(dú)立測(cè)序測(cè)序擴(kuò)增效果好，適應(yīng)高擴(kuò)增效果好，適應(yīng)高 GCGC含量片段、甚至含量片段、甚至FFPEFFPE樣本樣本Sanger 流程-混合測(cè)序454 流程-單克隆測(cè)序454454測(cè)序流程測(cè)序流程 測(cè)序測(cè)序1. 特異的測(cè)序引物和單鏈DNA模板結(jié)合, 加入一種dNTP2. DNA DNA 聚合酶聚合酶的作用下，單個(gè) dNTP與模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)3. 在ATPATP硫酸化酶硫酸化酶的作用下，PPi和APS結(jié)合形成ATP4.在熒光素酶熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光，被CCD捕捉5.5. Apyrase A

8、pyrase降解剩余的dNTP和殘留的少量ATP6.加入另一種dNTP重復(fù)2-5步驟7.在每一個(gè)測(cè)序循環(huán)里，堿基以同樣的次序(TACG)流過PicoTiterPlatePicoTiterPlate板8.當(dāng)模板鏈的互補(bǔ)核苷酸加入延伸鏈時(shí)，會(huì)產(chǎn)生了熒光信號(hào)9.熒光信號(hào)強(qiáng)度與所加入的核苷酸數(shù)目成比例10. 熒光信號(hào)被CCD照相機(jī)記錄熒光素酶熒光素酶ATP ATP 硫酸化酶硫酸化酶氧化熒光素氧化熒光素可見光可見光3. 3. 基于焦磷酸反應(yīng)的基于焦磷酸反應(yīng)的邊合成邊邊合成邊測(cè)序測(cè)序13Sequencing By Synthesis A A T C G G C A T G C T A A A A G T

9、C ACTARepeated dNTP flow sequence:GGTCAG TCA G TTTTCAGGATCCCGATTGCTAAnneal PrimerProcess continues until user-defined number of nucleotide flow cycles are completed.邊合成邊測(cè)序邊合成邊測(cè)序 實(shí)驗(yàn)體系的不斷優(yōu)化使得當(dāng)前可獲得實(shí)驗(yàn)體系的不斷優(yōu)化使得當(dāng)前可獲得Junior Junior 平均為平均為400bp400bp的讀長的讀長并將繼續(xù)以提升讀長為技術(shù)的發(fā)展方向之一并將繼續(xù)以提升讀長為技術(shù)的發(fā)展方向之一454454測(cè)序流程測(cè)序流程 數(shù)

10、據(jù)獲取數(shù)據(jù)獲取圖像處理圖像處理信號(hào)處理信號(hào)處理454454測(cè)序測(cè)序流程流程數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析測(cè)序與分析同時(shí)進(jìn)行，10小時(shí)完成10小時(shí)產(chǎn)出 10萬條以上的序列自帶4套軟件，滿足多數(shù)應(yīng)用需求軟件自動(dòng)過濾，高質(zhì)量序列比例高400bp 的位置仍可保持Q20的準(zhǔn)確性GS JuniorGS Junior在德國大腸桿菌事件中在德國大腸桿菌事件中Nicholas J Loman et al., Performance comparison of Performance comparison of benchtop high-throughput sequencing platformsbenchtop high

11、-throughput sequencing platforms, Nature Biotechnology, 2012 DOI: 10.1038/nbt.2198454 GS Junior擁有最長的讀長，平均讀長在522個(gè)堿基，99%的序列可以用于基因組拼接6月3日收到樣本，6月5日完成全部測(cè)序與機(jī)制確認(rèn)工作數(shù)據(jù)分析僅由HPA的非專業(yè)生信團(tuán)隊(duì)，不到半天時(shí)間即得到結(jié)果序列讀長分布圖序列讀長分布圖 Junior 測(cè)序系統(tǒng)運(yùn)行產(chǎn)生的讀長范圍為50-600bp，甚至更長 shot gun實(shí)驗(yàn)將利用幾乎全部數(shù)據(jù) 平均讀長平均讀長為400bp 典型讀長典型讀長在 450-550bp范圍 Amplion

12、實(shí)驗(yàn)將主要根據(jù)典型讀長進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)Number of readsReadlength (bases)Simple Simple simplesimpleCGTAGGCTAGATGCATGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATATAGCGATCTCGACATGCTComplex Complex 454 long reads454 long readsShort read technologyShort read technology? ? ? ? ? ?454 454 長測(cè)序能夠帶來什么長測(cè)序能夠帶來什么emPCR emPCR 保證樣本的獲得，長焦磷酸確

13、保閱讀保證樣本的獲得，長焦磷酸確保閱讀長讀長的價(jià)值長讀長的價(jià)值 一條reads通讀一個(gè)目標(biāo)序列，無需拼接，避免錯(cuò)誤產(chǎn)生與時(shí)間消耗 通過一條reads判斷突變的連鎖關(guān)系 更少引物獲得更多目標(biāo) 引物設(shè)計(jì)的區(qū)間更靈活Junior1條reads 既可通讀HBV耐藥相關(guān)基因的PCR產(chǎn)物HBVHBV耐藥耐藥RTRT基因基因(1032nt)(1032nt)檢測(cè)有檢測(cè)有overlapoverlap的的4 4個(gè)片段個(gè)片段Fragment1Fragment1(372 nt)(372 nt)9 9Fragment2(401 nt)9Fragment3(396nt)9Fragment4(314 nt)9The Jou

14、rnal of Infectious Disease, The Journal of Infectious Disease, May 2009; 199(9): 1275-85. PCRPCR擴(kuò)增子文庫的設(shè)計(jì)擴(kuò)增子文庫的設(shè)計(jì)長讀長給予更多引物設(shè)計(jì)空間，長讀長給予更多引物設(shè)計(jì)空間，1 1條條readsreads通讀熱點(diǎn)突變區(qū)域通讀熱點(diǎn)突變區(qū)域454 B B-primer (19 bp)Locus specific PCR amplificationemPCR & 雙向測(cè)序Target specific sequence (ca. 25 bp)454 A A-primer (19 bp)A

15、 AB BSequence of interest200 400 bp200 400 bp通過MID序列，可以混合多個(gè)樣本測(cè)序同時(shí)測(cè)序Data analysisRT基因可設(shè)計(jì)3個(gè)PCR產(chǎn)物片段S基因可設(shè)計(jì)2個(gè)PCR產(chǎn)物片段C基因可設(shè)計(jì)1個(gè)PCR產(chǎn)物片段X基因可設(shè)計(jì)1個(gè)PCR產(chǎn)物片段Pre-C基因可設(shè)計(jì)1個(gè)PCR產(chǎn)物片段454454測(cè)序在測(cè)序在HBV HBV 耐藥基因耐藥基因測(cè)序測(cè)序的的應(yīng)用方案應(yīng)用方案Day1 DNA 提取Day1 PCR產(chǎn)物的獲取Day1 PCR產(chǎn)物純化Day1 PCR產(chǎn)物樣品定量(Agilent2100, qPCR儀)Day1 PCR產(chǎn)物樣品均一化Day1 PCR產(chǎn)物混樣

16、Day1 454測(cè)序建庫加接頭(10min)Day2 emPCR擴(kuò)增(2h手工操作+6h機(jī)器運(yùn)行)Day3 454 Junior測(cè)序(10h)Day4 數(shù)據(jù)分析454 454 測(cè)序測(cè)序步驟步驟HBV耐藥檢測(cè)應(yīng)用 emPCR(乳滴PCR)擴(kuò)增 每一帶有MID與測(cè)序引物的HBV耐藥突變高發(fā)DNA片段在其各自的微乳滴中進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增，排除了其它競(jìng)爭(zhēng)性或污染性序列對(duì) PCR反應(yīng)的影響。 焦磷酸測(cè)序 將所有結(jié)合有DNA片段的磁珠置于PicoTiterPlate(PTP板)中進(jìn)行測(cè)序。PTP板的孔徑恰好僅能容納一顆磁珠。 將PTP板置于GS測(cè)序儀中，單個(gè)核苷酸依次流經(jīng)孔洞和DNA捕獲磁珠間。當(dāng)所加入的核苷酸

17、與模板互補(bǔ)時(shí)，便產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，進(jìn)而被GS系統(tǒng)的CCD相機(jī)記錄。454454的分析結(jié)果呈現(xiàn)的分析結(jié)果呈現(xiàn)可檢測(cè)單點(diǎn)突變454454的分析結(jié)果呈現(xiàn)的分析結(jié)果呈現(xiàn)可關(guān)注已知突變Multiple Mutations in a Codon Associated with Multiple Mutations in a Codon Associated with NRTI ResistanceNRTI ResistanceT69ConfidentialMultiple Mutations in a Codon Associated with Multiple Mutations in a Codon

18、Associated with NRTI ResistanceNRTI ResistanceThr69 35% Alanine, 42% Asparagine, and 1.2% SerineConfidential454454的分析結(jié)果呈現(xiàn)的分析結(jié)果呈現(xiàn)可檢測(cè)有意義的連鎖突變位點(diǎn)已有已有RTRT基因突變數(shù)據(jù)庫基因突變數(shù)據(jù)庫Standford HBVSeqStandford HBVSStandford HBVSeqStandford HBVSeq結(jié)果展示結(jié)果展示近兩年使用近兩年使用454 454 發(fā)表發(fā)表HBVHBV耐藥檢測(cè)文獻(xiàn)耐藥檢測(cè)文獻(xiàn)Analysis of hepatitis B vir

19、us drug-resistant mutant haplotypes by ultra-deep Analysis of hepatitis B virus drug-resistant mutant haplotypes by ultra-deep pyrosequencing. pyrosequencing. Ko SY, Oh HB, Park CW, Lee HC, Lee JE. (2012) Clin Microbiol Infect ePub:Ultra-deep pyrosequencing detects conserved genomic sites and quanti

20、fies linkage of Ultra-deep pyrosequencing detects conserved genomic sites and quantifies linkage of drug-resistant drug-resistant amino Acid amino Acid changes in the hepatitis B virus changes in the hepatitis B virus genome. genome. Rodriguez-Fras F, Tabernero D, Quer J, Esteban JI, Ortega I, Domin

21、go E, Cubero M, Cams S, Ferrer-Costa C, Snchez A, Jard R, Schaper M, Homs M, Garcia-Cehic D, Guardia J, Esteban R, Buti M. (2012) PLoS One 7(5):e37874.Long-term monitoring drug resistance by ultra-deep pyrosequencing in a chronic Long-term monitoring drug resistance by ultra-deep pyrosequencing in a chronic hepatitis B hepatitis B virus (HBVvirus (HBV)-infected patient exposed to several unsuccessful therapy )-infected patient exposed to several unsuccessful therapy schemes. schemes. Sede M, Ojeda D, Cassino L, Westergaard G, Vazquez M,