針對特定結(jié)構(gòu)域的分子標(biāo)記和高通量分子標(biāo)記

1、針對特定結(jié)構(gòu)域的分子標(biāo)記和高通量分子標(biāo)記 植物基因組中有無數(shù)保守的結(jié)構(gòu)域，可按照這些保守序列設(shè)計(jì)特異引物，開發(fā)特定的分子標(biāo)志。 (一)基于rga的分子標(biāo)志 迄今為止，來源于不同植物的20多種抗病基因已被克隆，分析結(jié)果顯示，這些來自不同植物的不同抗病基因大都具有一些共同的保守序列，如富含重復(fù)(leucine-rich re-peat, lrr)、結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide-binding site, nbs)、蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase, stk)等保守區(qū)域?；蛘哒f，在植物界，不同抗病基因可能具有一定的同源性。 抗病基因類似物(resistance gene

2、analog, rga)是按照抗病基因的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)的簡并引物舉行pcr的產(chǎn)物，由此衍生出來的標(biāo)志稱為rga標(biāo)志。rga既可以作為一種分子標(biāo)志，其本身又是潛在的(候選的)抗病基因。因此，這種rga擴(kuò)增技術(shù)(又稱同源序列法)是尋覓新的抗病基因的一種有效手段。例如，leister等(1996)按照擬南芥抗病基因rps 2和煙草抗病基因n的高度保守的lrr序列設(shè)計(jì)引物，對馬鈴薯基因組dna舉行pcr擴(kuò)增，獲得了與已知抗病基因同源、與抗線蟲病基因grol和抗晚疫病基因r7徹低連鎖的dna片段。kanazin等(1996)按照來自亞麻的l6、煙草的n和擬南芥的rps2等抗病基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，

3、擴(kuò)增大豆dna，起碼得到9類rga，其中一些被定位于大豆的已知抗病基因座位附近。 rga標(biāo)志可通過以下途徑獲得：簡并引物擴(kuò)增產(chǎn)物克隆、測序確認(rèn)為是rga后，其相對應(yīng)克隆可作為探針舉行rflp分析；因?yàn)楹啿⒁锏臄U(kuò)增產(chǎn)物是無數(shù)片段的混合體，瓊脂糖凝膠無法揭示其多態(tài)性，chen等(1998)利用6的變性凝膠電泳對簡并引物的擴(kuò)增產(chǎn)物挺直舉行分別，可產(chǎn)生多態(tài)性標(biāo)志；簡并引物的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆、測序后，按照所獲得的序列設(shè)計(jì)特異引物，然后采納aflp的分析手段舉行標(biāo)志的獲得，酶切和加接頭步驟與aflp相同，預(yù)擴(kuò)增和挑選性擴(kuò)增時一個引物來自于跟aflp相同的引物，另一引物則是rga特異引物；nbs-profil

4、ling技術(shù)，由van der linden等于2004年進(jìn)展。該技術(shù)的要點(diǎn)是先對基因組dna舉行酶切，然后加上特定的接頭，之后用簡并引物舉行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用高辨別力的凝膠電泳即可獲得多態(tài)性標(biāo)志。 (二)基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)志 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是真核生物中一類可移動因子，轉(zhuǎn)座需經(jīng)過由rna介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄過程而得名，可分為ltr反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和非ltr反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子以高拷貝在植物界廣泛分布，可以通過縱向和橫向分離在世代之間和不同種之間舉行傳遞，同一家族的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有高度的異質(zhì)性。因此，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可作為一種分子標(biāo)志。 基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)志有以下幾種。序列特異擴(kuò)增多態(tài)性(s

5、equence specific amplification polymorphism, ssap)，該技術(shù)由waugh等(1997)按照aflp改進(jìn)而來。其基本流程的酶切、加接頭和預(yù)擴(kuò)增與aflp相同，只是在舉行挑選性擴(kuò)增時，除了一個接頭同源引物外，另一個引物是按照反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的ltr末端保守序列而設(shè)計(jì)的。ssap的多態(tài)性來源有三：限制性位點(diǎn)及其兩側(cè)序列的變異、ltr 5末端的變異和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的變異。第一類變異和aflp所檢測的變異一樣，而后兩種變異都是因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子而產(chǎn)生。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子間區(qū)擴(kuò)增多態(tài)性(inter retrotransposon amplified polymor

6、-phism, irap)，該技術(shù)由kalendar等(1999)發(fā)明，用來檢測反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)間多態(tài)性的分子標(biāo)志。其原理是按照反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的ltr包含的保守序列而設(shè)計(jì)引物，這些引物在pcr過程中可以與ltr反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的相應(yīng)區(qū)域退火，從而擴(kuò)增出相鄰的同一家族的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子成員間的片段；也可按照反轉(zhuǎn)錄酶基因的相對保守序列設(shè)計(jì)引物舉行擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子一微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性(retrotransposon microsatellite amplified polymor-phism, remap)，該技術(shù)也是由kalendar等(1999)所發(fā)明，用來檢測反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和微衛(wèi)星之間多態(tài)性的分子標(biāo)志

7、。其原理是按照反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的ltr保守序列和微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物，然后舉行pcr，擴(kuò)增出反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與最臨近的微衛(wèi)星間的片段。remap檢測反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與容易重復(fù)序列之間的多態(tài)性(圖12-16)?；诜崔D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入的多態(tài)性(retrotransposon based insertion polymorphism, rbip)，該標(biāo)志是按照豌豆的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子pdri而設(shè)計(jì)的。用pdr1的反轉(zhuǎn)錄酶基因片段對豌豆屬的一個基因組文庫舉行篩選，找到包含有該反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的克隆，然后對其舉行測序，得到了包括反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子及其兩側(cè)序列的堿基挨次。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子一側(cè)的序列設(shè)為a，另一側(cè)設(shè)為e，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的保守序列

8、設(shè)為c。在沒有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子存在的狀況下，以a和e為引物，可以通過pcr擴(kuò)增出產(chǎn)物；假如有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入該區(qū)域，則因?yàn)閍和e之間距離太遠(yuǎn)而無法擴(kuò)增出產(chǎn)物，此時以c和e作為引物，則可以擴(kuò)增出條帶。 圖12-16remap暗示圖 高通量分子標(biāo)志 單位點(diǎn)與多位點(diǎn)分析技術(shù)到目前為止還是難以協(xié)調(diào)全都的。多位點(diǎn)分析(rapd,aflp等)在技術(shù)上相當(dāng)容易而高效，但存在顯著的缺陷和局限性，如顯性遺傳方式無法精確估量等位基因頻率、雜合度等，在分子進(jìn)化、種群遺傳等結(jié)果精確性要求比較嚴(yán)格的應(yīng)用受到嚴(yán)峻制約。而單位點(diǎn)標(biāo)志(rflp等)雖然分析結(jié)果牢靠但工作效率卻較低，不行能在大規(guī)模的遺傳分析中廣泛應(yīng)用。在許多討論領(lǐng)

9、域，包括qtl定位、系統(tǒng)演變、分子進(jìn)化等都涉及大量的分子標(biāo)志分析。因此，要求進(jìn)展高通量的分子標(biāo)志。 以凝膠為基礎(chǔ)的分子標(biāo)志可通過384孔pcr反應(yīng)、多重pcr、多重點(diǎn)樣及利用自動測序儀舉行電泳檢測等辦法來提高通量。然而，這些辦法仍不能滿足在遺傳育種中的少樣本多標(biāo)志或多樣本少標(biāo)志的需求。隨著對基因組討論的不斷深化，那些效率低的檢測辦法逐漸被摒棄，而操作會轉(zhuǎn)向自動化和大規(guī)?；＠?，以dna芯片的方式，同時舉行幾百個乃至上千個snp的分析，這樣就可以以高密度的多點(diǎn)單倍型的方式舉行連鎖分析。目前，無數(shù)商業(yè)公司都推出了能夠舉行高通量、大規(guī)模分析的snp分析平臺。除了snp外，以芯片為基礎(chǔ)的高通量分析平

10、臺還有sfp,dart和rad標(biāo)志。 sfp是被標(biāo)志的不同基因型的dna與同一個高密度寡核苷酸芯片舉行雜交，不同基因型dna雜交信號的顯著不同被檢測為sfp ; sfp分析中，芯片上的寡核苷酸行使著探針的功能并被描述為不同的特征。sfp是十分高效的分子標(biāo)志，玉米中利用sfp構(gòu)建了包含34000個sfp位點(diǎn)代表11000個基因的圖譜(zhu et al. , 2006)，番茄中構(gòu)建了包含8500個sfp位點(diǎn)代表6000個基因的圖譜(salmeron and zhu, 2007)；此外，sfp在小麥、水稻、大麥等作物中都有很好的應(yīng)用。 dart是高通量的基于微芯片雜交的技術(shù)，在序列未知的狀況下可同

11、時分析幾百個多態(tài)性位點(diǎn)。該技術(shù)已被證明可重復(fù)性強(qiáng)且便宜高效。dart標(biāo)志是特定基因組dna或通過差異雜交開發(fā)的多態(tài)性片段，表現(xiàn)為雙等位型顯性或共顯性。dart技術(shù)首先要開發(fā)“發(fā)覺芯片(discovery array)”用于鑒別多態(tài)性dart標(biāo)志。"discovery array"，開發(fā)于宏基因組(感愛好的種質(zhì)基因組的混合)并舉行了復(fù)雜性去除從而降低重復(fù)序列；之后單個克隆擴(kuò)增后點(diǎn)到玻璃片上制成“discovery array"。單個基因組的片段標(biāo)志后與芯片雜交就可獲得dart標(biāo)志。dart標(biāo)志已在水稻、大麥、小麥等作物中應(yīng)用。 rad標(biāo)志是基于微芯片技術(shù)的檢測全基因組單個酶切位點(diǎn)變異的標(biāo)志。rad分析時，首先要構(gòu)建全基因組的rad標(biāo)簽文庫，用于與挑選的微陣列舉行雜交從而在一次分析中檢測全部的酶切位點(diǎn)變異。其步驟包括：特定限制性內(nèi)切核酸酶酶切基因組dna;銜接生物素標(biāo)志的接頭；把銜接后的dna隨機(jī)剪切成比酶切位點(diǎn)間平均距離更小的片段，留下含有酶切位點(diǎn)及接頭的小片段；把片段固定在鏈霉抗生素蛋自包被的珠子上；用最初的酶酶切將dna標(biāo)簽從珠子上釋放出來。該過程可特異地分別限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)周圍的dna標(biāo)簽。不同樣品的rad標(biāo)簽與微陣列舉行雜交可舉行高通量的雜交圖譜分析。rad在模式生物