血府逐瘀膠囊、血塞通膠囊對溶血磷脂酸誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響(一)

1、血府逐瘀膠囊、血塞通膠囊對溶血磷脂酸誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響(一)    作者：王階,付瑩坤,方素萍,楊戈【摘要】 目的 觀察血府逐瘀膠囊及血塞通膠囊含藥血清對溶血磷脂酸(LPA)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖效應(yīng)的影響。方法 采用貼塊法培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC并分為7組：空白血清組,血府逐瘀膠囊含藥血清組,血塞通膠囊含藥血清組,3組分別LPA組,卡托普利含藥血清LPA組。以四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法觀察不同含藥血清對細(xì)胞增殖的影響；采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和DNA含量。結(jié)果 空白血清LPA組、血府逐瘀膠囊含藥血清組較空白血清組OD值升高

2、(P0.05),S期指數(shù)升高(P0.01)。血府逐瘀膠囊含藥血清LPA組、血塞通膠囊含藥血清LPA組較卡托普利含藥血清LPA組OD值降低(P0.05,P0.01)；S期指數(shù)升高(P0.01,P0.05)。結(jié)論 LPA、血府逐瘀膠囊對體外培養(yǎng)的VSMC有促增殖作用,血塞通膠囊無促增殖作用。血府逐瘀膠囊、血塞通膠囊對LPA誘導(dǎo)的VSMC增殖有拮抗作用,血塞通膠囊作用更強(qiáng)。其作用機(jī)制部分與抑制DNA合成、阻止細(xì)胞進(jìn)入S期有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 血府逐瘀膠囊；血塞通膠囊；溶血磷脂酸；血管平滑肌細(xì)胞；含藥血清Abstract：Objective To investigate the effect of th

3、e serums containing Xuefuzhuyu capsules and Xuesetong capsules on the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) induced by 1ysophosphatidie acid (LPA). Methods Rat VSMCs were obtainded by tissue-piece inoculation and divided into seven groups：blank serum group, Xuefuzhuyu (Xuesetong) caps

4、ules-containing serum group, LPAXuefuzhuyu (Xuesetong, captopril) containing serum group and LPAblank serum group. Effects of different groups on the proliferation of VSMCs was eva luated by MTT colorimetry. Analysis of cell cycle and DNA content were performed by flow cytometry. Results The optical

5、 density (OD) and the S phase fraction (SPF) of LPAblank serum group and Xuefuzhuyu capsules-containing serum group were more increased than the blank serum group (P0.05, P0.01). In comparison with LPAcaptopril containing serum group, OD of LPAXuefuzhuyu capsules-containing serum group and LPAXueset

6、ong capsules- containing serum group was decreased (P0.05, P0.01), SPF was increased (P0.01, P0.05). Conclusion Xuefuzhuyu capsules and LPA promoted the proliferation of VSMCs in vitro. Xuefuzhuyu and Xuesetong capsules can inhibit the proliferation induced by LPA, and effect of Xuesetong capsules w

7、as greater. Part of the mechanism may be associated with the inhibition of DNA synthesis and preventing the transition from G0/G1 to S phase of VSMCsKey words：Xuefuzhuyu capsule；Xuesetong capsule；lysophosphatidie acid；vascular smooth muscle cell；drug-containing serum動脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的增殖是經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)后再狹窄的

8、主要病理特征,有研究表明,心肌梗死后患者血清中含量明顯升高的溶血磷脂酸(LPA)可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖1、遷移2和去分化3,最終導(dǎo)致血管腔狹窄?；钛鲋兴幙蓮V泛用于心肌梗死后的干預(yù)治療,作為其代表藥物的血府逐瘀膠囊、血塞通膠囊對LPA誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察血府逐瘀膠囊、血塞通膠囊含藥血清對LPA誘導(dǎo)的體外大鼠VSMC增殖的不同影響,為活血化瘀藥在心肌梗死及心肌梗死介入后的選用提供可靠的理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。1 實(shí)驗(yàn)材料1.1 動物雄性SPF級SD大鼠50只,體重180230 g,購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所,許可證號：SCXK-軍2007-004。1.2 藥物血府

9、逐瘀膠囊,天津宏仁堂藥業(yè)有限公司(批號F03302)；血塞通膠囊,昆明圣火制藥有限公司(批號20070615)；卡托普利,施貴寶公司(批號0407021)。1.3 主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基、特級胎牛血清(FBS),美國GIBCO公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、LPA、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、RNaseA、胰蛋白酶(1250),美國Sigma公司；小鼠抗大鼠平滑肌肌動蛋白多克隆抗體(BM0002)、SP檢測試劑盒(SP-9002)、DAB顯色試劑盒,博士德生物公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.4 主要儀器恒溫CO2培養(yǎng)箱,Sanyo(日本)；倒置顯微鏡,OLYMPUS(日本)

10、；流式細(xì)胞儀,BD(美國)；酶標(biāo)儀,BIO-TEK(美國)；細(xì)胞培養(yǎng)板,Corning(美國)。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 含藥血清的制備SD大鼠隨機(jī)分為血府逐瘀膠囊組、血塞通膠囊組、卡托普利組、空白組,每組10只。按Meeh-Rubner氏公式給予10倍等效劑量的藥物,充分溶于生理鹽水后灌胃；空白組給予等體積的生理鹽水灌胃。每日2次,連續(xù)3 d。第4日給藥1次后1 h,腹主動脈采血,室溫靜置1 h,置4 過夜。3 000 r/min離心15 min,取上清,經(jīng)56 、30 min滅活,0.22 m濾膜過濾滅菌,-20 保存?zhèn)溆谩?.2 動脈血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定采用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC

11、。戊巴比妥麻醉大鼠,嚴(yán)格無菌條件下將主動脈剪斷取出,用加有雙抗的PBS液沖洗。將主動脈外膜撕去,沿縱軸剪開主動脈,眼科彎鑷輕輕刮去血管內(nèi)皮。將血管中膜剪成面積約1 mm×1 mm大小的組織塊,均勻貼于培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶豎直置于37 、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)23 h,待組織塊牢固貼于培養(yǎng)瓶后,即加入含20%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)置于37 、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。組織塊周圍生長增殖形成單層細(xì)胞,當(dāng)達(dá)到80%融合時(shí),即進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第46代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用相差倒置顯微鏡觀察VSMC,行形態(tài)學(xué)鑒定,并用-actin行免疫細(xì)胞化染色鑒定。2.3 分組及處理實(shí)驗(yàn)分為7組：空白

12、血清組、血府逐瘀膠囊含藥血清組、血塞通膠囊含藥血清組、空白血清LPA組、血府逐瘀膠囊含藥血清LPA組、血塞通膠囊含藥血清LPA組、卡托普利含藥血清LPA組。血清濃度均為10%,LPA達(dá)到終濃度為10 mol/L, PD98059終濃度為50 mol/L。干預(yù)時(shí)間為24 h。2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖取生長良好的對數(shù)生長期大鼠VSMCs,用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,以5×107 cells/L的密度接種于96孔板,200 L/孔,隨機(jī)分組,每組設(shè)10個(gè)平行孔。置于37 、 5%CO2孵育箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長至70%80%融合狀態(tài)時(shí),更換為0.1%FBS的DMEM培養(yǎng)2

13、4 h,使細(xì)胞同步化,然后加入不同處理因素的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h,在孵育結(jié)束前4 h每孔加入濃度為5 g/L的MTT 10 L,培養(yǎng)4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔各加入DMSO 150 L,37 孵育15 min后震蕩混勻,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度值(OD值,檢測波長570 nm)。2.5 PI法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期6孔板各孔加入不同處理因素的培養(yǎng)基24 h后,0.25%胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌2次,調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106個(gè)/mL,逐滴加入預(yù)冷的70%乙醇固定,4 過夜。次日,離心,棄乙醇, PBS洗滌, 用含有終濃度為20 mg/mL RNaseA 酶的50

14、mg/L的PI染液避光染30 min,用300目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞后,流式細(xì)胞儀檢測。應(yīng)用CellQuestPro軟件獲取至少20 000個(gè)細(xì)胞的熒光2(FL-2A)直方圖,通過ModiFit軟件分析細(xì)胞周期分布。3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)用x±s表示,經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn),計(jì)量資料多組均數(shù)的比較采用方差分析,組間均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn),P0.05表明組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4 結(jié)果4.1 不同含藥血清對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響(見表1)表1 不同含藥血清對VSMC增殖的影響(略)注：與空白血清組比較,*P0.05,*P0.01；與空白血清LPA組比較,#

15、P0.05,#P0.01；與卡托普利含藥血清LPA組比較,P0.05,P0.01(下同)4.2 不同含藥血清對血管平滑肌細(xì)胞周期的影響(見表2)表2 不同含藥血清對VSMC周期S期指數(shù)的影響(略)4.3 動脈血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定結(jié)果組織塊接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)57 d,有細(xì)胞爬出,23周可逐漸鋪滿整個(gè)瓶底,成典型的峰谷樣生長,倒置相差顯微鏡下觀察,單個(gè)平滑肌細(xì)胞形態(tài)多樣,呈梭形、多角形、星形或不規(guī)則形,有多個(gè)細(xì)胞突起,胞漿豐富,胞質(zhì)密度高,不透明,核卵圓形居中,有多個(gè)核仁。第3代的細(xì)胞經(jīng)特異的平滑肌-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定,大于95%的細(xì)胞胞漿染色呈陽性。5 討論以往研究表明,血管損傷后新

16、生內(nèi)膜的主要成分之一是VSMC4-5。從中草藥中篩選有效的抗VSMC增殖藥物,將為防治再狹窄開辟新的途徑。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)VSMC,部分模擬心肌梗死后體內(nèi)過程與血清藥理學(xué)方法相結(jié)合,是觀察中藥作用的一種較為理想的方法。LPA被稱為細(xì)胞間的“多功能磷脂信使”,具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)6。研究發(fā)現(xiàn),血清LPA的含量與急性心肌梗死的發(fā)病密切相關(guān)7。急性心肌梗死7 d后血清LPA水平仍高于正常水平。LPA作為一種重要的VSMC 絲裂素原,最終導(dǎo)致血管腔狹窄8。本研究顯示,血府逐瘀膠囊與LPA對VSMC均有促進(jìn)增殖作用,血府逐瘀膠囊與血塞通膠囊對LPA誘導(dǎo)的VSMC增殖有拮抗作用,其中血府逐瘀膠囊與卡托普

17、利的作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而血塞通膠囊的作用較之更強(qiáng)。細(xì)胞周期分布的變化能夠通過DNA含量的變化具體地反映出各種因素刺激后對細(xì)胞增殖的影響。S期是DNA合成期,S期指數(shù)是處在S期的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。S期指數(shù)升高,表明細(xì)胞的DNA合成增快,細(xì)胞增殖加速。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LPA和血府逐瘀膠囊含藥血清都能夠通過促進(jìn)DNA合成,加速細(xì)胞有絲分裂,發(fā)揮其促VSMC增殖作用。血府逐瘀膠囊、血塞通膠囊含藥血清拮抗LPA誘導(dǎo)的VSMC增殖作用也部分是通過抑制DNA合成、降低S期指數(shù)實(shí)現(xiàn)的,其中血塞通膠囊的抑制作用更明顯,與卡托普利無差別,而卡托普利幾乎完全抑制了LPA的促進(jìn)DNA合成作用。綜上所述,本

18、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LPA對VSMC確有促增殖作用,且其作用是通過促進(jìn)細(xì)胞DNA合成實(shí)現(xiàn)的。血府逐瘀膠囊對正常VSMC也有促增殖作用,區(qū)別于血塞通膠囊。二者對LPA誘導(dǎo)的VSMC增殖都有拮抗作用,部分是通過抑制細(xì)胞DNA合成,減緩細(xì)胞有絲分裂實(shí)現(xiàn)的,血塞通膠囊這方面的作用更明顯。說明在心肌梗死及心肌梗死介入后使用活血化瘀藥能夠防止再狹窄的發(fā)生。但結(jié)合MTT及周期的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)并非活血化瘀藥發(fā)揮作用的唯一途徑,以及是何原因?qū)е铝搜痧瞿z囊、血塞通膠囊對正常VSMC的不同作用,臨床在中醫(yī)辨證的基礎(chǔ)上該如何選用還有待進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】1 Gennere I, Xuereb JM, Simon MF, et a1. Effects of lysop