實(shí)驗(yàn)一生活污水(含藥廠廢水)的細(xì)菌學(xué)檢查(綜合性實(shí)驗(yàn))

1、實(shí)驗(yàn)一生活污水（含藥廠廢水）的細(xì)菌學(xué)檢查（綜合性實(shí)驗(yàn)）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的方法2了解水源水的平板菌落計(jì)數(shù)的原則3.了解PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)污染水體大腸埃希菌的意義和基本原理4掌握PCR操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)材料：1培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。2材料 水樣3儀器及其他用具 恒溫培養(yǎng)箱、三角燒瓶，帶玻璃塞瓶，培養(yǎng)皿，移液器（1mL），移液管（1mL），試管等，PCR儀，水浴鍋，培養(yǎng)箱，電泳儀，自動(dòng)微量移液器（各型號(hào)），濾膜，PCR管，離心管，Whatman 3MM濾紙或相當(dāng)產(chǎn)品。4. 試劑及溶液 含有適當(dāng)抗菌素的LB培養(yǎng)基，Taq DNA聚合酶，正向引物(20 mmol/L

2、）及反向引物(20mmol/L）溶于水中，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，乙酸銨（l0mol/L），無(wú)水乙醇， TSEL (50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，20%蔗糖，50mmol/L EDTA，1 mg/ml溶菌酶）， SSK (50mmo1/L NaCl, 1%SDS, 3mg/mL蛋白酶K)， TE緩沖液，l0×擴(kuò)增緩沖液(500mmol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl，15mmol/L，MgC12）。 4種dNTP貯存液（20mmol/L，pH8.0 )，瓊脂糖溶液(0.7%），電泳緩沖液(1×TAE)，溴化乙錠染色液，6×凝膠上樣緩

3、沖液。 4.儀器及其他用具實(shí)驗(yàn)原理：本實(shí)驗(yàn)采用平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)。由于水中細(xì)菌種類繁多，它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)和其他生長(zhǎng)條件的要求差別很大，不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有的細(xì)菌均能生長(zhǎng)繁殖。因此，以一定的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)出來(lái)的菌落計(jì)算得到的水中細(xì)菌總數(shù)僅是一種近似值。目前一般是采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)。大腸埃希菌（Escherichia coli )是指示糞便污染的重要指示物。當(dāng)水體中出現(xiàn)大量的E. coli就說(shuō)明近期內(nèi)水體受到了糞便污染（因其脫離寄主后，其半存留期會(huì)大大縮短）。PCR檢測(cè)這種微生物非常靈敏，即使每100mL水中只有一個(gè)個(gè)體，也能被檢驗(yàn)出來(lái)。實(shí)

4、驗(yàn)內(nèi)容：（一）細(xì)菌總數(shù)測(cè)定自來(lái)水(1)用滅菌移液管或移液器吸取lmL水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中。(2)分別傾注約15mL已融化并冷卻到45左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，并立即在桌上作平面旋搖，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。(3)另取一空的滅菌培養(yǎng)皿，傾注牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15mL，作空白對(duì)照。(4）培養(yǎng)基凝固后，倒置于37溫箱中，培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)即為lmL水樣的細(xì)菌總數(shù)。池水、河水或湖水等（1)稀釋水樣：取3個(gè)滅菌空試管，分別加入9mL滅菌水。取lmL水樣注入第一管9mL滅菌水內(nèi)、搖勻，再自第一管取lmL至下一管滅菌水內(nèi)，如此稀釋到第三管，稀釋度分別為10-1，10-2

5、與10-3。稀釋倍數(shù)看水樣污染程度而定，以培養(yǎng)后平板的菌落數(shù)在30300個(gè)之間的稀釋度最為合適，若三個(gè)稀釋度的菌數(shù)均多到無(wú)法計(jì)數(shù)或少到無(wú)法計(jì)數(shù)，則需繼續(xù)稀釋或減小稀釋倍數(shù)。一般中等污染水樣，取10-1，10-2,10-3三個(gè)連續(xù)稀釋度，污染嚴(yán)重的取10-2，10-3，10-4三個(gè)連續(xù)稀釋度。(2)自最后三個(gè)稀釋度的試管中各取1mL稀釋水加入空的滅菌培養(yǎng)皿中。每一稀釋度做兩個(gè)培養(yǎng)皿。(3)各傾注15mL己融化并冷卻至50左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，立即放在桌上搖勻。(4)凝固后倒置于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h.。菌落計(jì)數(shù)方法(1) 先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。若其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長(zhǎng)時(shí)，

6、則不應(yīng)采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌苔生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。(2) 選擇平均菌落數(shù)在30300之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該水樣的細(xì)菌總數(shù)。(3) 若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均在30300之間，則按兩者菌落總數(shù)之比值來(lái)決定。若其比值小于2，應(yīng)采取兩者的平均數(shù)；若大于2，則取其中較小的菌落總數(shù)。(4) 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。(5) 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。(6) 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，則以”近300或30

7、的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（二）應(yīng)用PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)污染水體大腸埃希菌1水樣的處理及模板DNA的制備(1) 取水樣lmL，低速(2 000 r/min )離心5min，以除去不溶性雜質(zhì)。取出上清，經(jīng)6 000 r/min離心5min，收集菌體。(2) 將菌體懸于100 mlTSEL溶液中，置37水浴作用30 min。(3) 向反應(yīng)混合物中加入300ml SSK溶液，置37繼續(xù)作用60 min。(4) 向反應(yīng)混合物中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，搖勻后置-20，2h. 12 000 r/min離心15 min，收集沉淀，室溫晾干后將沉淀物溶于100300ml無(wú)菌去離子水或TE緩沖液中備用。如果是純培養(yǎng)的

8、菌落，即將菌落挑入100ml無(wú)菌去離子水中，加熱煮沸l(wèi)min，即可作為PCR模板。2引物設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)的引物來(lái)自E. coli的lac Z和lam B基因。 lac Z引物1：ZL-1675（5'-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3'） 引物2：ZR-2025（5'-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3'）lam B引物1：BL-4910(5'-CTGATCGAATGGCTGCCAGGCTCC-3'）引物2：BR-5219 (5'-CAACCAGACGATAGTTATCACGCA-3'）3PCR擴(kuò)增體系 按以下次序，將各成分加在0.5mL PCR薄壁管內(nèi)混合： l0×擴(kuò)增緩沖液5ml 20mmo1/L 4種dNTP混合液（pH8.0）1ml 20mmo1/L正向引物2.5ml 20mmo1/L反向引物2.5ml 模板DNA 510ml Taq DNA聚合酶12單位 補(bǔ)足H2O至總體積50ml4PCR循環(huán)按以下方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，典型的程序有變性、復(fù)性和聚合（延伸