異源雙鏈和單鏈構像多態(tài)法篩查基因突變

1、論著本課題受廣東省自然科學基金(編號:960149和衛(wèi)生部回國人員啟動基金資助作者單位:510060廣州,中山醫(yī)科大學中山眼科中心暨衛(wèi)生部眼科學實驗室(張清炯、肖學珊、黎仕強、申煌煊、張豐生、吳開力,醫(yī)學遺傳學教研室(曾瑞萍異源雙鏈和單鏈構像多態(tài)法篩查基因突變張清炯肖學珊黎仕強申煌煊張豐生曾瑞萍吳開力【摘要】目的比較異源雙鏈、單鏈構像多態(tài)(SSCP 、異源雙鏈2SSCP 法篩查突變的效率,尋找簡便有效的基因突變篩查方法。方法應用聚合酶鏈反應(PCR 擴增23個已知的雜合子突變,分別以異源雙鏈、SSCP 、異源雙鏈2SSCP 法分析突變,對比各方法對突變的檢出情況。結果23個雜合子突變中,異源雙

2、鏈法、SSCP 法與異源雙鏈2SSCP 法檢出突變分別為22個(96%、20個(87%和23個(100%。異源雙鏈法結果比SSCP 法結果穩(wěn)定,重復性好,兩種方法之間有一定互補性,異源雙鏈2SS 2CP 法兼有兩種方法的特點。結論異源雙鏈2SSCP 法突變檢出率高,經(jīng)濟、簡便,值得在基因突變篩查中推廣應用?！娟P鍵詞】DNA 突變分析多態(tài)現(xiàn)象,單鏈構象核酸異源雙鏈分子Comp arison of heteroduplex ,SSCP,and heteroduplex 2SSCP analyses in mutational screening ZhangQingjiong ,Xiao Xuesh

3、an ,Li Shiqiang ,et al 3Zhongshan Ophthalmic Center ,Sun Yat 2sen Univer sity o f Medical Sciences ,Guangzhou 510060【Abstract 】Objective T o com pare the effectiveness of heteroduplex ,SSCP and heteroduplex 2SSCP analy 2ses in mutational screening.Methods DNA sam ples with 23known heterozyg ous muta

4、tions were am plified by PCR.The PCR products were then analyzed by heteroduplex ,SSCP and heteroduplex 2SSCP analyses separately to testify the effectiveness of each method.R esults O f the 23mutations ,22were detected by heteroduplex analysis (96%,20by SSCP analysis (87%and 23by heteroduplex 2SSCP

5、 analysis (100%.Results from heteroduplex analysis are m ore stable and repeatable than those of SSCP and they may com plement each other.Heteroduplex 2SS 2CP analysis has the advantages of heteroduplex and SSCP analyses.Conclusion Heteroduplex 2SSCP analysis is sim ple ,economical and m ore effecti

6、ve than SSCP or heteroduplex analysis alone and it may be widely applied in mutational screening.【K ey w ords 】DNA mutational analysis S ingle 2stranded con formational polym orphism Nucleic acid heteroduplexes基因突變檢測是遺傳病病因分析與基因診斷的重要環(huán)節(jié)?；诰酆厦告湻磻?PCR 產(chǎn)物分析的微小未知基因突變篩查方法,包括SSCP 、異源雙鏈、變性與溫度梯度凝膠電泳、RNA 酶裂解、化

7、學錯配裂解、直接測序等,適用于涉及少數(shù)堿基的基因突變檢測1,2。這些方法中,SSCP 法3使用最廣泛,而異源雙鏈法4,5最簡便,并已證實在直接檢出未知微小突變方面的效率。SSCP 法須用多條件分析,且結果不穩(wěn)定、重復性差,對大于200bp 片段中點突變檢出的效率差,因而許多PCR 產(chǎn)物須酶解后分析1,2,比較繁瑣又費時費錢。異源雙鏈分析結果穩(wěn)定,可分析較大片段(350bp 中的點突變1,2,6,7。我們曾對異源雙鏈法與SSCP 法篩查突變的情況作了初步比較分析7,并創(chuàng)立異源雙鏈2SSCP 法篩查基因突變8。我們分別應用異源雙鏈、SSCP 、異源雙鏈2SSCP 三種方法檢測分布于20個DNA 片

8、段中的23個突變,并進行了比較。材料和方法一、基因組DNA 制備抽取20例已知基因突變的遺傳病(先天性紅、綠色覺異常和視網(wǎng)膜母細胞瘤患者外周靜脈血,以全血溶解法制備外周血白細胞基因組DNA 。二、標準突變及PCR 擴增分布于20個DNA 片段中的23個突變見附表,其中5個突變分別分布于2種DNA 片段中,另有1個突變樣品有3處堿基變異(融合基因片段。每個882Chin J M ed Lab Sci ,September 1998,V ol 21,N o.5樣品中均有正常與突變拷貝各1個,為雜合性突變。附表被檢標本堿基突變性質與位置及突變檢出情況編號PCR產(chǎn)物(bp突變性質突變位置(nt+突變檢

9、出3異源雙鏈SSCP異源雙鏈2SSCP1206G del40+2227A del90+3116A del23+4250T del97+-+5184T del114+62435bp del103107+71435bp del5155+8294GC90+9185T ins.85+ 10212CT73+ 11182TC121-+ 12277GT153+ 13197GT99+ 14221CT99+-+ 15221G T del179180+ 16221GT102+ 17221CT64+-+ 18350CT164+ 19221C del104+ 20264CT96+ 21167CT34+ 22260AC

10、115+ 23260CT154+CG158TA192檢出陽性份數(shù)222023檢出百分比(%9687100注:所有PCR產(chǎn)物中的突變均為雜合子;+突變位置從PCR產(chǎn)物正鏈5端計;3指突變可以(+或不能(-被該方法檢出,突變性質通過克隆測序得來,檢測中均以正常DNA作為對照使用20對引物分別對含有23個雜合性突變的樣品DNA進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物長度見附表。PCR產(chǎn)物均經(jīng)過2%3%NuSieve(FMC,US A瓊脂糖凝膠電泳確認,然后直接進行突變檢測分析(不必經(jīng)限制性內切酶酶切。三、突變檢測1.SSCP分析:PCR產(chǎn)物稀釋24倍后與等容積2×加樣緩沖液(97%甲酰胺,20mm ol

11、/L E DT A, 0.05%溴酚藍及二甲苯氰混合,于96變性5分鐘后置于冰上冷卻,然后取25l混合物在6%聚丙烯酰胺凝膠于15或控制在室溫下30W電泳9小時。用銀染色法檢測觀察DNA帶紋。21異源雙鏈分析:PCR產(chǎn)物與等容積2×加樣緩沖液(97%甲酰胺,20mm ol/L E DT A,0.05%溴酚藍及二甲苯氰混合,然后取14l混合物在8%聚丙烯酰胺凝膠于室溫下或1530W電泳89小時。用銀染色法檢測觀察DNA帶紋。3.用異源雙鏈2SSCP法篩查基因突變:(1PCR 產(chǎn)物與等容積2×加樣緩沖液混合,于96變性5分鐘后置于冰上冷卻5分鐘,然后立即取14l在8%的聚丙烯酰

12、胺凝膠于室溫下30W電泳89小時。用銀染色法檢測觀察DNA帶紋。在此條件下異源雙鏈帶紋比SSCP帶紋好。(2根據(jù)PCR擴增的效率,PCR產(chǎn)物略為稀釋(或不稀釋后與等容積2×加樣緩沖液(97%甲酰胺,20mm ol/L E DT A,0. 05%溴酚藍及二甲苯氰混合,于96變性5分鐘后置于冰上冷卻5分鐘,然后立即取25l在6%的聚丙烯酰胺凝膠(40cm×30cm×1mm,1×T BE,含10%甘油于15下30W電泳89小時。用銀染色法檢測觀察DNA帶紋。在此條件下SSCP帶紋比異源雙鏈帶紋好。結果23個雜合性突變分布于116350bp的20個DNA片段中,

13、異源雙鏈法可檢出22個突變(96%, SSCP可檢出20個突變(87%,而異源雙鏈2SSCP聯(lián)合法可檢出全部23個突變(附表。從附表可以看出,突變的檢出與否同堿基組成成分、突變位置無明確關系。3個未被SSCP法檢出、1個未被異源雙鏈法檢出的突變中,1個為缺失突變、3個為單堿基置換。有趣的是,N o.17和N o. 18為同一外顯子中同一突變,N o.17的DNA片段較短,反而其中的突變未能被SSCP法檢出。3個未被SSCP法檢出的突變,其所在DNA片段長度均>200 bp;而20個可被SSCP法檢出的突變中,13個突變所在的DNA片段長度>200bp。僅1個分布于184bp 片段中

14、的單堿基置換未能被異源雙鏈法檢出。3例不能被SSCP法檢出的突變均可被異源雙鏈法檢出,而1例不能被異源雙鏈法檢出的突變則可被SSCP 法檢出。異源雙鏈法2SSCP法具有兩種方法的特點,可檢出所有23個突變。在結果觀察中我們發(fā)現(xiàn),大部分突變雖然可同時被SSCP法和異源雙鏈法檢出,但有的SSCP帶紋變異明顯、有的異源雙鏈帶紋變異明顯(附圖,單用一種方法分析有時難以確定是否有突變,容易出現(xiàn)假陽性與假陰性。在我們分析的23個突變中沒有一個突變出現(xiàn)兩種帶紋都不清晰或不明顯的情況,982中華醫(yī)學檢驗雜志1998年9月第21卷第5期上部為SSCP分析結果,下部為異源雙鏈分析結果,上、下對應樣品相同。第5道為

15、一單堿基置換(表1編號10,其SS2CP帶紋變異明顯,而異源雙鏈帶紋變異則不明顯(在銀染色過程中清晰可見兩條緊鄰帶紋。第9、10道分別為單堿基置換和2bp缺失(表1編號14、15,其異源雙鏈帶紋變異明顯,而SSCP帶紋變異則不明顯。第11道為單堿基置換(表1編號16,僅見異源雙鏈帶紋異常圖1異源雙鏈法與SSCP法檢測突變的比較總有一種帶紋異常比較明顯。由于異源雙鏈2SSCP 法可同時有兩種方法的結果,相互補充與印證,故具有明顯的優(yōu)越性。如在用聯(lián)合法分析紅與綠色覺基因外顯子5的260bp RCR產(chǎn)物中,紅色覺基因片段(r與綠色覺基因片段(g,p之間在中部分別有10(r/g和11(r/p個堿基差異

16、;綠色覺基因片段g 與p之間有一個堿基差別。通過異源雙鏈2SSCP聯(lián)合法分析可以明確確定來源于紅與綠色覺基因的不同片段。討論SSCP法是基于單鏈構像多態(tài)來分離不同DNA 片斷3,而異源雙鏈是基于雙鏈構像多態(tài)來分離不同DNA片斷46。聯(lián)合應用兩種方法,在同一凝膠中基于不同機制來檢測同一突變,理應有一定互補性和優(yōu)越性,因此我們在工作中摸索建立了異源雙鏈2SSCP法8。該法集合了異源雙鏈和SSCP兩種方法的優(yōu)點,通過控制待檢樣品變性與復性過程、待檢樣品與變性劑的比例、電泳條件等,在同一電泳膠中既可觀察到異源雙鏈帶紋、又可觀察到SSCP 帶紋,突變檢出率高于單用SSCP或單用異源雙鏈,同時也提高了突變

17、檢出結果的可靠性,而操作與SSCP分析類似(未增加試劑、設備和難度,值得在突變篩查、DNA多態(tài)分析和臨床基因診斷中推廣應用。異源雙鏈2SSCP法的突變檢測原理:雜合性DNA樣品在變性解鏈成單鏈后,既可復性形成4種雙鏈(包括正常同源雙鏈、突變同源雙鏈、突變正鏈與正常負鏈之異源雙鏈、突變負鏈與正常正鏈之異源雙鏈、又可不復性而形成4類多種立體構像單鏈(突變正鏈、突變負鏈、正常正鏈、正常負鏈四類。一個雜合性DNA樣品經(jīng)異源雙鏈2SSCP聯(lián)合法分析后,不同單、雙鏈DNA在凝膠電泳過程中由于其立體構像、凝膠分辨率等多種因素的影響,在雙鏈帶紋區(qū)可出現(xiàn)14條帶,在單鏈帶紋區(qū)可出現(xiàn)少至1條、多至4條以上的帶紋。

18、如果PCR產(chǎn)物未經(jīng)極度稀釋,在急劇降溫條件下可同時形成SSCP和異源雙鏈。用異源雙鏈SSCP聯(lián)合法對純合突變進行分析時,應加入等量正常PCR產(chǎn)物混合后變性,然后進行電泳分析。參考文獻1G rom pe M.The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids.Nature G enetics,1993,5:111.2D ownton S B,S laugh RA.Diagnosis of human heritable diseases2labora2 tory approaches and outcome.Clin Chem,19

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