醫(yī)藥衛(wèi)生層析分離純化技術課件

1、1層析分離純化技術層析分離純化技術2001.11.28 Shanghai Pudong2蛋白質(zhì)純化策略蛋白質(zhì)純化策略融合蛋白質(zhì)融合蛋白質(zhì)非融合蛋白質(zhì)非融合蛋白質(zhì)表達表達簡單純化簡單純化一步一步 親和層析親和層析90 - 97 % 純度純度更高純度更高純度三步純化策略三步純化策略粗提粗提中度純化中度純化精細純化精細純化多步純化多步純化3簡易純化選擇簡易純化選擇載體和標記載體和標記純化純化pGEX谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 GST MicroSpin Purification Module,GSTrap, Glutathione Sepharose Fast FlowPQE6 x 組氨酸His Micr

2、oSpin Purification ModulepETHisTrap, HiTrap Chelating, 6 x組氨酸Chelating Sepharose Fast FlowpEZZ 18 (非誘導性表達) 蛋白 A 的 IgG 結(jié)合區(qū) IgG Sepharose 6 Fast FlowpRIT2T (利用溫度改變誘導)蛋白 A 的 IgG 結(jié)合區(qū) IgG Sepharose 6 Fast Flow4GST 融合蛋白的純化融合蛋白的純化GST重組蛋白重組蛋白 酶切位點酶切位點Factor Xa:Mr 17-20 000 / 28-30 000Thrombin: Mr 37 000PreS

3、cission Protease:Mr 46 000Glutathione Sepharose Mr 26 00010C5任何規(guī)模純化都比較簡單任何規(guī)模純化都比較簡單預裝柱預裝柱/填料填料一次可純化一次可純化 GST注意注意融合蛋白的量融合蛋白的量GST MicroSpin 400 g立即可用, 預裝柱, Purification Module 緩沖液和試劑和 MicroPlex 24 Vacuum 結(jié)合使用可以大大增加處理量(一次處理 48 樣品)GSTrap 1 ml10 - 12 mg立即可用, 預裝柱GSTrap 5 ml50 - 60 mg立即可用, 預裝柱Glutathione S

4、epharose 4B8 mg / ml可自行裝柱Glutathione Sepharose 410 -12 mg / ml可自行裝柱，使用層析系統(tǒng)快速純化，F(xiàn)ast Flow 適合放大6GST MicroSpin Purification Module 立即可用立即可用, 50 預裝柱含緩沖預裝柱含緩沖液和所需試劑液和所需試劑 可純化每柱可純化每柱 400 g, 體積達體積達400 l 樣品樣品適合蛋白質(zhì)擴增系統(tǒng)篩選和優(yōu)化，小規(guī)模純化適合蛋白質(zhì)擴增系統(tǒng)篩選和優(yōu)化，小規(guī)模純化7GSTrap 柱柱 20 分鐘內(nèi)分鐘內(nèi) 每每 1 ml 柱柱 12 mg 或或 每每 5 ml 柱柱 60 mg 使用

5、針筒，蠕動泵，或者使用針筒，蠕動泵，或者 KTA 系統(tǒng)系統(tǒng) 添加劑兼容添加劑兼容適合快速和重復性高的要求適合快速和重復性高的要求8GSTrap結(jié)合緩沖液平衡加樣后用結(jié)合緩沖液沖洗 廢液收集用洗脫緩沖液洗脫收集組份3 min5-15 min2 min9GSTrapSDS PAGE analysis020406080100% Elution buffer00.51.01.52.02.53.03.55.010.015.020.0ml minWashElutionbuffer2.7 mg pure GST fusion protein5.010.015.020.0A280kD9414.420.1304

6、3671 2 3柱柱:GSTrap 1 ml樣品樣品:8 ml 大腸桿菌表達含 GST 融合蛋白胞漿萃取液結(jié)合緩沖液結(jié)合緩沖液:PBS, pH 7.3洗脫緩沖液洗脫緩沖液50 mM Tris-HCl, pH 8.0 10 mM 還原谷胱甘肽流速流速:1 ml/min層析層析 步驟步驟:4 CV結(jié)合緩沖液, 8 ml 樣品, 10 CV結(jié)合緩沖液, 5 CV洗脫緩沖液, 5 CV結(jié)合緩沖液(CV = 柱體積) 系統(tǒng)系統(tǒng):KTAexplorer 101:低分子量標記 (LMW) Calibration kit, 還原, Amersham Pharmacia Biotech2:胞漿萃取液, 1 g

7、/10 ml3:洗脫GST 融合蛋白10Glutathione Sepharose Fast Flow適合裝填在高效層析柱中和層析系統(tǒng)結(jié)合使用，適合裝填在高效層析柱中和層析系統(tǒng)結(jié)合使用，并用作放大并用作放大 每毫升填料可以純化每毫升填料可以純化 12 mg 融合蛋白融合蛋白 裝在裝在 XK 空柱中和空柱中和 KTA 平臺純化平臺純化系統(tǒng)連接使用系統(tǒng)連接使用 高流速高流速 兼容尿素，鹽酸胍等兼容尿素，鹽酸胍等11GST 融合蛋白的檢測融合蛋白的檢測檢測方法檢測方法注意注意GST 96 孔板 ELISA 檢測試劑盒適合篩選表達系統(tǒng)和層析組份當表達蛋白的含量不明或需要高靈敏度 時特別有用GST 酶測

8、定檢測模組快速測定；適合篩選用途 功能測定可以有效評估純化出來的 GST 融合蛋白的活性，但可能需要自行設計和優(yōu)化12GST融合蛋白的檢測融合蛋白的檢測檢測方法檢測方法注意注意使用抗-GST 抗體和高度特異, 只檢測 GST 融合蛋白ECL 檢測系統(tǒng)的使用適當濃度的二級HRP標記抗體可以免疫印跡法 使背景大大減低，甚至去掉ECL 檢測系統(tǒng)提高免疫印跡的檢測能力ECL 提供大部分重組表達應用所需的靈敏 度需要更高靈敏度時使用 ECL Plus.SDS-PAGE Coomassie 提供分子量大小和 % 純度訊息.考馬氏染色或銀染 可檢測融合蛋白和污染物.13GST 96-孔板孔板 ELISA 檢

9、測試劑盒檢測試劑盒 快速酶測定快速酶測定 每塊板可檢測每塊板可檢測 50 樣品樣品 適合篩選表達系統(tǒng)和層析組適合篩選表達系統(tǒng)和層析組份份14(His)6 融合蛋白的純化和檢測融合蛋白的純化和檢測重組蛋白重組蛋白HisHisHisNi2+HisHisHisHisNi2+Ni2+Ni2+15任何規(guī)模純化都比較簡單任何規(guī)模純化都比較簡單預裝柱預裝柱/填料填料一次可純化一次可純化 注意注意融合蛋白的量融合蛋白的量His MicroSpin 100 g立即可用, 預裝柱,Purification Module 緩沖液和試劑和 MicroPlex 24 Vacuum 結(jié)合使用可以大大增加處理量(一次處理

10、48 樣品)HiTrap Chelating 1 ml 12 mg立即可用, 預裝柱HisTrap Kit 12 mg/柱含預裝柱和足夠 12 純化的緩沖液HiTrap Chelating 5 ml 60 mg立即可用, 預裝柱Chelating Sepharose Fast Flow 12 mg/ml 自行裝填到空柱和放大用 16His MicroSpin 純化模組純化模組 立即可用立即可用, 50 預裝柱連緩沖液預裝柱連緩沖液和試劑和試劑 每柱可純化達每柱可純化達 100 g, 體積達體積達 400 l 樣品樣品適合蛋白質(zhì)擴增系統(tǒng)的篩選和優(yōu)化，小規(guī)模純化適合蛋白質(zhì)擴增系統(tǒng)的篩選和優(yōu)化，小規(guī)

11、模純化17HisTrap Kit 每根每根 HiTrap Chelating 金屬螯合柱金屬螯合柱可在少於可在少於 25 分鐘中純化分鐘中純化 12 mg 融合蛋融合蛋白白 包含所需濃縮緩沖液和工具包含所需濃縮緩沖液和工具 使用針筒，蠕動泵，或者使用針筒，蠕動泵，或者 KTA 系統(tǒng)系統(tǒng) 添加劑兼容添加劑兼容快速，重復性好和容易使用快速，重復性好和容易使用18HiTrap Chelating準備柱子 用 H2O 洗加 NiSO4 再用 H2O 洗加樣用平衡緩沖液沖洗柱子廢液收集用洗脫緩沖液洗脫融合蛋白收集組份3 min5-15 min2 min用平衡緩沖液平衡柱子廢液3 min19HiTrap

12、ChelatingSDS PAGEFlow through加樣結(jié)合液洗脫液結(jié)合液AA280280AA4054051.00.50.00.700.600.500.400.300.200.100.05.010.015.020.0Volume (ml)ElutedpoolW ashkDa94.067.043.020.114,41 2 3 4 5 6 7 8樣品樣品:5 ml大腸桿菌表達含(His)-標記谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，GST-(His)6柱柱:HiTrap Chelating 1 ml, 加 Ni2+結(jié)合緩沖液結(jié)合緩沖液: 1X 磷酸緩沖液, 20 mM 咪唑 pH 7.4洗脫緩沖液洗脫緩沖液: 1X

13、 磷酸緩沖液, 500 mM咪唑 pH 7.4流速流速: 2 ml/min, 312 cm/h結(jié)果結(jié)果:洗脫 GST-(His)6, 4 ml, A280: 1.65 總量: 4.46 mg1:低分子量標記 (LMW) 2:樣品稀釋 1:203:穿透稀釋 1:104:沖洗液5:洗脫 GST-(His)6,稀釋 1:206:洗脫 GST-(His)6,稀釋 1:107:GST 標準品, 0.5 mg/ml8:LMW20Chelating Sepharose Fast Flow適合自行裝柱和放大適合自行裝柱和放大 每毫升填料可純化高達每毫升填料可純化高達 12 mg 融合蛋白融合蛋白 裝在裝在 X

14、K 空柱中和空柱中和 KTA 平臺純化系統(tǒng)平臺純化系統(tǒng)連接使用連接使用 高流速高流速 兼容添加劑兼容添加劑21檢測檢測 (His)6 融合蛋白融合蛋白檢測方法檢測方法注意注意ELISA 測定標記 IgG高特異性，只檢測 (His)6 融合蛋白功能測定可有效評估純化出來的 (His)6 融合蛋白是否具備活性 不一定能買到可能需要自行設計和優(yōu)化22檢測檢測 (His)6 融合蛋白融合蛋白檢測方法檢測方法注意注意使用抗-His 抗體和高度特異, 只檢測 (His) 6 融合蛋白ECL 檢測系統(tǒng)的使用適當濃度的二級HRP標記抗體可以免疫印跡法 使背景大大減低，甚至去掉ECL 檢測系統(tǒng)提高免疫印跡的檢測

15、能力ECL 提供大部分重組表達應用所需的靈敏度需要更高靈敏度時使用 ECL Plus.SDS-PAGE Coomassie 提供分子量大小和 % 純度訊息.考馬氏染色或銀染 可檢測融合蛋白和污染物.23其他融合其他融合 或或 非融合蛋白的純化非融合蛋白的純化 (1/3) 如果有對應配基，使用親和層析如果有對應配基，使用親和層析-一步純化一步純化-高靈敏度高靈敏度-高載量高載量24其他融合其他融合 或或 非融合蛋白的純化非融合蛋白的純化 (2/3)立即可用的 HiTrap 柱應用應用 預裝柱預裝柱抗體分離抗體分離 所有來源的 IgG，其亞族，和片斷 HiTrap Protein A 和 HiTr

16、ap rProtein A包括人源IgG3 ，小鼠 IgG1和大鼠 IgGHiTrap Protein G的 IgG，其亞族，和片斷 腹水，血請，體液，和細胞培養(yǎng)液的 MAbTrap GII (HiTrap Protein G column (1 ml), 單克隆和多克隆 IgG 工具, 濃縮緩沖液)雞蛋請的 IgY HiTrap IgY 單克隆和人源 IgMHiTrap IgM25其他融合其他融合 或或 非融合蛋白的純化非融合蛋白的純化 (3/3)立即可用的 HiTrap 柱應用：應用：基團特異填料基團特異填料 預裝柱預裝柱白蛋百, 多種核酸依賴酶, HiTrap Blue 凝血因子, DN

17、A 結(jié)合蛋白, a2-巨球蛋白外露氨基酸: His (Cys, Trp) HiTrap Chelating的蛋白和多肽 e.g. a2-巨球蛋白和干擾素生物素和含生物素物質(zhì)HiTrap Streptavidin凝血因子, 脂蛋白酶，HiTrap Heparin膽固醇受體, 激素, DNA結(jié)合蛋白, 干擾素,蛋白質(zhì)合成因子活化好的親和柱自行掛上配基活化好的親和柱自行掛上配基 HiTrap NHS-activated偶連一級氨基26其他融合其他融合 或或 非融合蛋白的純化非融合蛋白的純化 準備配基準備配基 (e.g. 抗體抗體) 準備柱子準備柱子 (e.g. NHS-activated HiTra

18、p) 現(xiàn)成方法現(xiàn)成方法 優(yōu)化結(jié)合和洗脫條件優(yōu)化結(jié)合和洗脫條件 使用針筒，蠕動泵，或者使用針筒，蠕動泵，或者 KTA 系統(tǒng)操作的系統(tǒng)操作的 HiTrap 小柱小柱制作一支特異親和純化柱制作一支特異親和純化柱27其他融合其他融合 或或 非融合蛋白的檢測非融合蛋白的檢測生物活性生物活性Native PAGEIEFMS分子大小蛋白質(zhì)酶切SDS-PAGE免疫印跡免疫印跡MS N-端測序端測序聚合物差異性pH 穩(wěn)定性, 離子強度, 蛋白質(zhì)和 清潔劑濃度結(jié)構(gòu)變異N-端差異28去處小分子去處小分子 純化后純化后 (His)6 融合蛋白的咪唑融合蛋白的咪唑 酶切后的酶切后的 GST 或或 His 標記標記 多余

19、的鹽多余的鹽/尿素尿素/鹽酸胍鹽酸胍 用用 HiTrap Desalting 將樣品轉(zhuǎn)移到另一種緩沖液中將樣品轉(zhuǎn)移到另一種緩沖液中，e.g. 儲存用或改變儲存用或改變 pH29交換緩沖液和去鹽的柱子交換緩沖液和去鹽的柱子 快速有效快速有效 高處理量高處理量 去鹽去鹽, 交換緩沖液交換緩沖液, 去掉低分子量物質(zhì)去掉低分子量物質(zhì)柱子柱子樣品體積樣品體積樣品洗脫體積樣品洗脫體積MicroSpin G-25 0.1-0.15 ml0.1-0.15 mlHiTrap Desalting0.25-1.5 ml1.0-2.0 mlHiPrep 26/10 Desalting2.5-15 ml7.5-20 m

20、l30交換緩沖液和去鹽的柱子交換緩沖液和去鹽的柱子HiTrap Desalting咪唑在鹽峰中一并被去除咪唑在鹽峰中一并被去除00.050.100.15AU280nm UV 280 nm 電導(His) 融合蛋白鹽峰6注射(His)6 融合蛋白融合蛋白31選擇純化設備選擇純化設備純化需要純化需要MicroSpinSyringe + KTA 系統(tǒng)系統(tǒng) +PurificationHiTrap HiTrap Modulescolumnscolumns快速，高處理量篩選(GST or (His)6 融合蛋白)非常快速，一步純化 (適合大部分融合蛋白)一步純化 (適合大部分融合蛋白)優(yōu)化以提高純度 常規(guī)

21、實驗，重復性好 純化后蛋白復性 32選擇純化設備選擇純化設備 多步純化多步純化 (非融合性蛋白或需要更高純度非融合性蛋白或需要更高純度) 工藝開發(fā)和優(yōu)化工藝開發(fā)和優(yōu)化 法規(guī)需要法規(guī)需要 e.g. GLP/GMP 純化工藝放大純化工藝放大 轉(zhuǎn)移工藝到更大規(guī)模轉(zhuǎn)移工藝到更大規(guī)模使用使用 KTAFPLC 或或 KTAexplorer 系統(tǒng)系統(tǒng):33大腸桿菌包涵體表達大腸桿菌包涵體表達 (His)6 融合蛋白的融合蛋白的擴增，純化和復性擴增，純化和復性詳細步驟詳細步驟34過程過程細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)收獲細胞收獲細胞細胞破碎細胞破碎離心離心5 - 10 000g沉淀物沉淀物沖洗和離心沖洗和離心分離包涵體分離

22、包涵體HiTrap Chelating Ni2+ 純化和復性純化和復性溶解溶解35 每每 100 ml 培養(yǎng)液重新懸浮細胞沉淀培養(yǎng)液重新懸浮細胞沉淀物於物於 4 ml 20 mM Tris -HCl pH 8.0 在冰浴情況下，用超聲震蕩破碎細在冰浴情況下，用超聲震蕩破碎細胞，并在胞，并在+4C下高速離心下高速離心 10 分鐘分鐘 重新懸浮細胞沉淀物於重新懸浮細胞沉淀物於 2 ml 含含 e.g. urea 的沖洗緩沖液和再度超聲震蕩的沖洗緩沖液和再度超聲震蕩 并在并在+4C下高速離心下高速離心 10 分鐘分鐘 用沖洗緩沖液沖洗細胞沉淀物用沖洗緩沖液沖洗細胞沉淀物包涵體包涵體 - 細胞破碎細胞

23、破碎, 沖洗和分離沖洗和分離2 M UREA20 mM Tris HCl2% Triton X1000.5 M NaCl36溶解和準備樣品溶解和準備樣品 重新懸浮細胞沉淀物於重新懸浮細胞沉淀物於 5 ml 溶解緩沖液溶解緩沖液 (e.g.):20 mM Tris -HCl, 0.5 M NaCl,5 mM 咪唑, 6 M 鹽酸胍,1 mM 2-巰基乙醇巰基乙醇pH 8在室溫等 30-60 分鐘在+4C 離心 15 分鐘用 0.22 m 或 0.45 m 濾膜過濾37準備準備 HiTrap Chelating 柱柱 沖洗沖洗 5 ml H2O 加加 0.5 ml 0.5 M NiSO4 沖洗沖洗

24、 5 ml H2O 用用 5-10 ml 20 mM Tris -HCl, 5 mM 咪唑咪唑, 6 M 鹽酸胍鹽酸胍,1 mM 2-巰基乙醇巰基乙醇pH 8 結(jié)合緩沖液洗柱結(jié)合緩沖液洗柱最最多多 5 分鐘分鐘38純化和復性純化和復性稀釋樣品, 用 10 ml 結(jié)合緩沖液洗柱，5 mM 咪唑, 6 M 鹽酸胍, pH 8.0上樣，并以 20 mM咪唑, 6 M 尿素 pH 8.0 緩沖液洗柱線性梯度： 6 to 0 M 尿素 最少 30 柱體積流速： 0.1 ml/min - 1 ml/min用沒有尿素緩沖液沖洗 5 個柱體積線性梯度: 20 mM - 500 mM 咪唑10 - 20柱體積用

25、 HiTrap Desalting 交換緩沖液去除咪唑1.00.750.50.250102030 40506065mlManually using a syringe: Sample loading Gua-HCl wash Urea wash Startelutionfr. 38fr. 42fr. 46fr. 49fr. 40Start refold- ingA28039組份分析組份分析1: LMW2: 樣品3-6:鹽酸胍沖洗物7, 8: 尿素沖洗物1: LMW2-6:組份 38-427,8: 組份 48, 491.00.750.50.2505101520mlA280kD9467433020

26、.114.412345678kD9467433020.114.412345678Superdex 75 HR 10/30SDS PAGE PhastGel Gradient 1015樣品稀釋前處理樣品稀釋前處理:用 15% SDS, 30% 2-巰基乙醇+10 mM Tris+1 mM EDTA稀釋1:5HiTrap Chelating 1 mlSuperdex 75 HR 10/3040多維蛋白質(zhì)純化多維蛋白質(zhì)純化41高效純化策略高效純化策略載量載量速度速度分辯率分辯率回收率回收率42減少處理步驟減少處理步驟得率 (%)95% / 步90% / 步85% / 步80% / 步75% / 步0

27、2040608010012345678步驟43準備工作準備工作 考慮考慮: 純度水平純度水平 需要量需要量 保持生物活性保持生物活性 有效和經(jīng)濟有效和經(jīng)濟 蛋白質(zhì)特性蛋白質(zhì)特性: 穩(wěn)定性穩(wěn)定性- pH- 離子強度離子強度- 溫度溫度 分子量分子量 等電點等電點44pH 的重要性的重要性: 蛋白質(zhì)凈電荷隨蛋白質(zhì)凈電荷隨 pH 改變改變滴定曲線蛋白質(zhì)凈電荷蛋白質(zhì)凈電荷 1210穩(wěn)定性范圍用陽離子交換用陽離子交換用陰離子交換用陰離子交換3pH不同 pH 下的分離情況21+-45pH 的重要性的重要性: 蛋白質(zhì)凈電荷隨蛋白質(zhì)凈電荷隨 pH 改變改變流動相的流動相的 pH 選擇性選擇性VVV陽離子陰離子

28、pH0+-VVVVVAbsAbsAbsAbs表面凈電荷Abs Abs Abs Abs46樣品準備樣品準備考慮考慮: 根據(jù)蛋白質(zhì)來源選擇不同萃取方法根據(jù)蛋白質(zhì)來源選擇不同萃取方法 使用溫和的步驟減少酸化和釋放蛋白酶使用溫和的步驟減少酸化和釋放蛋白酶 在室溫以下快速處理在室溫以下快速處理 用緩沖液維持用緩沖液維持 pH, 離子強度離子強度目的目的: 穩(wěn)定樣品穩(wěn)定樣品47三步純化策略三步純化策略Step 純度粗提粗提 中度純化中度純化 精細純化精細純化 樣品準備樣品準備,萃取萃取,凈化凈化 達到最高純度達到最高純度去除大部分雜質(zhì)去除大部分雜質(zhì) 分離分離, 濃縮濃縮和穩(wěn)定樣品和穩(wěn)定樣品48三步純化策略

29、三步純化策略步驟步驟層析填料的層析填料的顆粒大小顆粒大小49三步純化策略三步純化策略步驟步驟流速流速50三步純化策略三步純化策略步驟步驟分辯率分辯率51粗提粗提目的目的 純化粗樣純化粗樣 快速濃縮快速濃縮 (減少體積減少體積) 和穩(wěn)定樣品和穩(wěn)定樣品 (去除蛋白去除蛋白酶酶)最適用層析技術最適用層析技術: 離子交換離子交換 / 疏水層析疏水層析分辯率快速快速回收率載量載量52粗提粗提: 離子交換填料離子交換填料預裝柱預裝柱 20ml顆粒大小顆粒大小流速流速HiPrep 16/10 Q XL & SP XL 90 m 10 ml/minHiPrep 16/10 DEAE & CM

30、90 m 10 ml/minSepharose Big BeadsSTREAMLINESepharose Fast Flow53粗提粗提: 疏水層析填料疏水層析填料 高載量高載量 高流速高流速HiPrep 16/10 Phenyl (高 & 低取代)HiPrep 16/10 ButylHiPrep 16/10 OctylHiTrapHIC 選擇試劑盒放大54中度純化中度純化目的目的 去除大部分雜質(zhì)去除大部分雜質(zhì)最適用層析技術最適用層析技術: 離子交換離子交換 / 疏水層析疏水層析HiLoad離子交換和疏水層析預裝柱分辯率分辯率快速回收率載量載量55中度純化中度純化: 離子交換填料離子交

31、換填料Sepharose HP 34 mQ & SP150 cm/hr小包裝和預裝柱小包裝和預裝柱 交聯(lián)瓊脂醣交聯(lián)瓊脂醣SOURCE 30 mSepharose High PerformanceSOURCE 30 Q & S 25 mg 上樣載量上樣載量3 m: Mini Q & SMini Beads Q & S 2 mg上樣載量上樣載量61精細純化精細純化:離子交換和疏水層析填料離子交換和疏水層析填料RESOURCE15 mQ, S, Phenyl, Ether, Isopropyl1 ml 預裝柱流速高達預裝柱流速高達10 ml/min RESOURCE

32、HIC Test Kit62精細純化精細純化:反相層析填料反相層析填料SephasilRPC硅膠硅膠3 mC2/C18聚苯乙烯聚苯乙烯/二乙烯基苯二乙烯基苯120 : 肽類肽類C4, C8, C185 and 12 m硅膠硅膠100 : 肽類肽類300 : 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)pH 1 - 12 (14)肽類肽類5, 15 and 30 m63Source30 m15 m5 m離子交換/疏水層析/反相層析反相層析離子交換/反相層析64適用於三步純化策略的層析技術適用於三步純化策略的層析技術蛋白質(zhì)性質(zhì)蛋白質(zhì)性質(zhì)層析技術層析技術凈電荷離子交換(IEX)大小凝膠過濾(GF)疏水性疏水層析(HIC), 反相層

33、析(RPC)生物辯識 (配基特異性)親和層析(AC)配基特異性，凈電荷, 擴張柱床吸附技術 (EBA) 疏水性有AC, IEX or HIC65適用於三步純化策略的層析技術適用於三步純化策略的層析技術層析技術層析技術主要特色主要特色粗提粗提中度純化中度純化精細純化精細純化IEX高分辨率高載量快速HIC分辨率好載量一般快速AC高分辨率高載量快速GF高分辨率RPC高分辨率66適用於三步純化策略的層析技術適用於三步純化策略的層析技術層析技術層析技術樣品起始狀態(tài)樣品起始狀態(tài)樣品結(jié)束狀態(tài)樣品結(jié)束狀態(tài)IEX低離子強度高離子強度或 pH 改變樣品體積不受限制樣品被濃縮樣品被濃縮HIC高離子強度低離子強度樣品

34、被濃縮樣品被濃縮AC特異性結(jié)合特異性洗脫條件樣品體積不受限制樣品被濃縮樣品被濃縮GF樣品體積受限制交換緩沖液 (2 M (NH4)2SO4容易氧化78DAOCS - 一般準則一般準則 在所有緩沖液中加在所有緩沖液中加 DTT 使所有半胱氨酸使所有半胱氨酸殘基保持還原狀態(tài)殘基保持還原狀態(tài) 加入蛋白酶抑制劑以保持生物活性加入蛋白酶抑制劑以保持生物活性 用用 SDS PAGE 檢查每一個組份中檢查每一個組份中 DAOCS 利用酶測定法測量生物活性利用酶測定法測量生物活性79準備樣品準備樣品懸浮細菌細胞在溶解緩沖液中懸浮細菌細胞在溶解緩沖液中超聲震蕩破碎細胞超聲震蕩破碎細胞DNA 沉淀沉淀利用離心沉淀

35、利用離心沉淀來源:從 S. Clavuligerus 克隆得到的DAOCS 基因 和在大腸桿菌的胞漿中擴增80選擇粗提的層析技術選擇粗提的層析技術 陰離子交換陰離子交換: 快速快速, 濃縮濃縮 樣品處理最簡單樣品處理最簡單 分離基礎分離基礎: 電荷電荷 因為因為 DACOS 的的酸性酸性 pI 和不穩(wěn)定性，和不穩(wěn)定性，所以緩沖液選擇中性所以緩沖液選擇中性 pH81粗提粗提 - 在在 KTAFPLC 上優(yōu)化梯度上優(yōu)化梯度線性梯度線性梯度步級梯度步級梯度優(yōu)化梯度優(yōu)化梯度層析柱層析柱:HiPrep 16/10 Q XL系統(tǒng)系統(tǒng):KTAFPLC0102030min0100200300100200300

36、4000020406080mAUmlmS/cm01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min82選擇中度純化技術選擇中度純化技術 HIC: 分離基礎分離基礎: 疏水性疏水性 蛋白質(zhì)疏水性質(zhì)很難預測蛋白質(zhì)疏水性質(zhì)很難預測: 篩選適合填料篩選適合填料 HIC 可以跟可以跟 IEX 互補銜接互補銜接, 減少樣品處理步驟減少樣品處理步驟 (只只需要加鹽需要加鹽) DAOCS 在高鹽下能保持穩(wěn)定在高鹽下能保持穩(wěn)定83選擇精細純化的層析技術選擇精細純化的層析技術 GF:分離基礎分離基礎: 分子量差異分子量差異 GF: 最適合分離雙體，寡聚體和聚合最適合分離雙體，寡聚體和聚合物物84DAOCS - 優(yōu)化好的粗提步驟優(yōu)化好的粗提步驟層析柱層析柱:HiPrep 16/10 Q XL系統(tǒng)系統(tǒng):KTAFPLC濃縮樣品濃縮樣品快速去除有害物質(zhì)快速去除有害物質(zhì)01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm85DAOCS -優(yōu)化好的中度純化步驟優(yōu)化好的中度純化步驟層析