基于靜電沉積殼聚糖鉑納米顆粒復合膜構(gòu)建葡萄糖生物傳感器

1、第23卷第6期2010年6月傳感技術(shù)學報CH I N ESE JOURNAL OF SE NS ORS AND ACT UAT ORSVol .23No .6Jun .2010項目來源:甘肅省科技支撐計劃資助項目(0708GKC A062收稿日期:2009-12-30修改日期:2010-01-28Electrodepositi on of Chitos an and Pl ati n u m Nanoparti cles forFabr i cati on of an Ampero metri c Glucose Bi osensor3FAN Zengjie,MA L iping,L I Yu

2、nxia,L I U Guohan,L I Gongnong,HAN Genliang3(Institute of Sensor Technology,Gansu Province A cade m y of Sciences,L anzhou 730000,China Abstract:A composite fil m via depositi on of chit osan /p latinu m nanoparticles was constructed on a g old electr ode using electriche m ical methods .Glucose bi

3、osens or was f or med with glucose oxidase i m mobilized in composite i m mo 2bilizati on me mbrane matrix,which was composed of chit osan and p latinu m nanoparticles by using glutaraldehyde as a cr oss 2linking agent .The res ponse ti m e of bi osens or is only about 8s,with a range fr om 110-5t o

4、 110-3mol/L and a detecti on li m it of 1.410-5Key words:bi osens or;i m mobilizati on enzy me;glucose oxidase;chit osan;p latinu m nanoparticles EEACC:7230J基于靜電沉積殼聚糖鉑納米顆粒復合膜構(gòu)建葡萄糖生物傳感器3范增杰,馬莉萍,李云霞,劉國漢,李工農(nóng),韓根亮3(甘肅省科學院傳感技術(shù)研究所,蘭州730000摘要:利用電沉積方法對殼聚糖/鉑納米顆粒復合膜進行組裝,以戊二醛作為交聯(lián)劑固定葡萄糖氧化酶,構(gòu)建葡萄糖生物傳感器。實驗結(jié)果表明:制得的葡

5、萄糖生物傳感器響應時間僅為8s,線性測量范圍為110-5110-3mol/L,檢測限為1.410-5mol/L (S/N =3.0。該傳感器靈敏度高,穩(wěn)定性好。關(guān)鍵詞:生物傳感器;固定化酶;葡萄糖氧化酶;殼聚糖;鉑納米顆粒中圖分類號:TP212.2文獻標識碼:A 文章編號:1004-1699(201006-0764-04葡萄糖氧化酶包含一個核黃素腺嘌呤二核苷,其為葡萄糖氧化酶的氧化還原中心,但其深深包埋于酶蛋白內(nèi)部,使酶與固體基底電極間的電子轉(zhuǎn)移比較困難1,而金屬納米材料的發(fā)現(xiàn)很好的解決了這一問題。主要是由于納米材料具有較高的比表面積和較高的吸附性能,能夠改善酶的活性中心和基底電極間電子傳遞的

6、效率2-4,使酶電極的電流響應靈敏度得到顯著提高。金屬納米顆粒逐漸取代電子媒介體成為電化學反應中優(yōu)良的電子媒介。目前利用金屬納米顆粒修飾電極制備傳感器檢測葡萄糖的研究已有很多報道,主要有納米金5-6、納米銀7、納米銅8和納米鉑9-10等。對于金納米顆粒應用于傳感器的研究較多也相對比較成熟,但是對于鉑納米顆粒的研究相對較少,一些研究發(fā)現(xiàn)鉑納米顆?？梢越档蛡鞲衅鞯墓ぷ麟娢?1,對過氧化氫具有一定的催化作用12。殼聚糖不易溶于水、堿溶液和稀的硫酸、磷酸,可溶于HCl 、HNO 3和HAc 等酸中13-14成膜后具有很好的吸附性、穩(wěn)定性和良好的生物相容性,其豐富的氨基也使它被廣泛用于生物分子的固定和修

7、飾電極的制備15。由于殼聚糖含有很多氨基基團,其pKa 大約是6.3,當溶液的pH 低于6.3,此時殼聚糖溶液為水溶狀態(tài),當pH 高于6.3時,此時殼聚糖溶液由水溶狀態(tài)變?yōu)椴蝗軤顟B(tài)16。通過靜電沉積殼聚糖成膜后,該膜具有良好的選擇透性和較強的抗干擾能力。本文將鉑納米顆粒用于葡萄糖傳感器的構(gòu)造,制成了葡萄糖氧化酶/鉑納米顆粒/殼聚糖/金電極電流型生物傳感器,以測定葡萄糖的含量。實驗發(fā)現(xiàn)鉑納米顆粒具有良好的催化性能。該傳感器具有制作過程簡單、靈敏度高、檢測限低、穩(wěn)定性好等特點。第6期范增杰,馬莉萍等:基于靜電沉積殼聚糖鉑納米顆粒復合膜構(gòu)建葡萄糖生物傳感器1實驗部分1.1試劑與儀器葡萄糖氧化酶(G

8、OD和殼聚糖(CS,脫乙酰度85%購自Sig ma公司;H2Pt CL66H2O,Na BH4,葡萄糖,鐵氰化鉀,亞鐵氰化鉀和氯化鉀均為分析純。實驗用水為三蒸水。電化學工作站為LK22005,測試系統(tǒng)為三電極體系,金電極(直徑3mm為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑片為輔助電極。1.2金電極清潔金電極先用麂皮打磨,再以平均粒徑為0.05m的氧化鋁砂漿打磨成鏡面,用蒸餾水沖洗干凈后于80的Piranha(H2S O4-H2O2,體積比3:1溶液中浸泡3m in,除去有機物等難以除去的雜質(zhì)。電極取出后用蒸餾水反復沖洗。分別放入乙醇、蒸餾水中超聲洗滌,用蒸餾水沖洗干凈,在0.1mol/L的H2S

9、 O4中反復中進行循環(huán)伏安掃描,掃描電位范圍-0.2+1.4V,直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線。1.30.5%殼聚糖溶液的制備將50mg殼聚糖溶于10mL1%的乙酸中,超聲3h,直至完全溶解,用濃的氫氧化鈉將其pH調(diào)至4.0-5.0。1.4含鉑納米顆粒殼聚糖的制備按照文獻17,取配制好的殼聚糖加入1mL 0101mmol/L的H2Pt Cl66H2O,超聲10m in,最后加入50L新配制的5%的Na BH4溶液將高價鉑還原成鉑納米顆粒,生成的鉑納米顆粒直徑約30n m。1.5酶電極的制備將清潔好的金電極置于含鉑納米顆粒的殼聚糖溶液中,于恒電位-1.5V下,靜電沉積120s。隨著氫離子的析出,溶液

10、的pH逐漸升高,當pH超過6.3時,含鉑納米顆粒的殼聚糖溶液由可溶狀態(tài)變?yōu)椴蝗軤顟B(tài),并在金電極表面形成一層含鉑納米顆粒的殼聚糖薄膜。取出涼干,接著浸入0.25%的戊二醛交聯(lián)2h,經(jīng)去離子水水洗,然后置于2mg/ 100LG OX中浸泡12h,取出用P BS清洗,即可制得傳感器,不用時于4的冰箱中保存。1.6測量方法采用三電極系統(tǒng):以所研制的金電極為工作電極,飽和甘汞電極(SCE為參比電極,鉑片為對電極;以0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PH7.0為支持電解質(zhì),35下,加入不同濃度的葡萄糖,在0.5 -0.2V范圍內(nèi)進行循環(huán)掃描,記錄循環(huán)伏安掃描曲線。計時電流法測定時,工作電位為0.4V(vsS

11、CE,攪拌時測定。2結(jié)果與討論2.1電極表征鐵氰化鉀的循環(huán)伏安法是表征修飾電極電子傳遞能力的一種方便而有效的方法。圖1是不同修飾電極在5.0mMFe(CN64-/3-(0.1mol/L KCl中的循環(huán)伏安特性曲線。圖中,a為裸金電極,b為殼聚糖鉑納米顆粒修飾電極,c為固定葡萄糖氧化酶后的電極。從圖1可以看出b比a的峰電流明顯增大,電流增大主要是由于鉑納米顆粒沉積于金電極表面,加快電子轉(zhuǎn)移速率造成的。c比b的氧化峰電流明顯減小,主要是由于固定葡萄糖氧化酶后,使電極表面電阻增大,電流減小造成的 。圖1不同修飾電極循環(huán)伏安圖2.2pH的影響圖2給出了溶液pH對電極電流響應的影響曲線,從圖可以看出從4

12、.5開始隨著pH的升高,傳感器響應電流相應增大,當pH為7.0時,傳感器的響應電流達到最大,說明該傳感器的最佳pH為7.0。因此實驗選擇pH7.0的磷酸鹽緩沖液作為底液 。圖2pH的影響2.3溫度影響圖3給出了溫度對酶電極電流響應的影響曲線。可以看出,當溫度升高到60的時候,電流響應值仍呈升高趨勢,表明采用上述固定方法可以在很寬的溫度范圍內(nèi)保持酶的活性,擴大了酶電極的使用范圍,在實際測量中,567傳感技術(shù)學報第23卷我們使用的溫度是35,該溫度與人體體溫相當,接近實際測量的溫度。 圖3溶液溫度對電極電流影響2.4電流時間曲線靈敏度和響應時間是傳感器的兩個重要的參數(shù),實驗采用電流時間曲線進行測定

13、。所用電解質(zhì)溶液為0.1mol/L 的P BS (pH 7.0,通過磁力攪拌實現(xiàn)液體對流。測試時,工作電位設(shè)為0.4V ,每次待i 2t 曲線平穩(wěn)后連續(xù)加入一定體積的10mmol/L 的葡萄糖溶液記錄電流變化。圖4為傳感器對葡萄糖溶液進行測試時得到的i 2t 曲線,從圖中可以看出連續(xù)加入葡萄糖后,酶電極的響應電流較大,而且響應電流的穩(wěn)定性很好。從電流時間曲線的局部放大圖(圖5中可以看到,酶電極具有很好的響應速度,加入底物后響應電流能很快達到平衡,平均響應速度約8S 左右。 圖4傳感器對葡萄糖響應的i -t曲線圖 圖5時間電流的局部放大2.5酶電極的線性線性檢測范圍和檢測極限也是傳感器的兩個重要

14、的參數(shù),通過不同濃度的葡萄糖溶液獲得不同大小的響應電流而繪制出該傳感器的校正曲線(圖7。從圖6可以看出,隨著底物葡萄糖濃度的不斷增高,傳感器氧化峰響應電流不斷增大,而還原峰響應電流不斷減小。酶電極的響應電流與葡萄糖濃度在110-5110-3mol/L 的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y =0.00662x +0.32037(x 葡萄糖的濃度mol/L;y 響應電流,A ,R 2=01997。該傳感器的檢測限根據(jù)公式18(1dl =3Sb /m (1式中dl 為檢測限,Sb 為平衡電流的標準偏差,m 為校正曲線的斜率值,檢測限計算值為1.410-5mol/L (S /N =3.0米氏常數(shù)K

15、 m app是酶促反應的特征動力學參數(shù),是表征酶活性物質(zhì)與底物之間親和力大小的統(tǒng)計標準,表觀米氏常數(shù)可以根據(jù)Shu 和W ils on 19提出的電流法求得(公式21I ss =K m I max 1C -1I max(2其中:I ss 為穩(wěn)態(tài)電流,I max 為最大電流,K m 為表觀米氏常數(shù),C 為葡萄糖的濃度。酶電極的米氏常數(shù)經(jīng)計算為1.19mmol/L,此處表觀米氏常數(shù)K m 遠遠小于文獻中所報道的值20,表明用該方法制作的傳感器對葡萄糖氧化酶具有更大的親和力。圖6生物傳感器在不同濃度的葡萄糖溶液中的循環(huán)伏安曲線圖圖7酶電極的校正曲線2.6酶電極的穩(wěn)定性將該傳感器在510-3mol/L

16、 的葡萄糖中重復測定10次,其相對偏差為3.8%,該傳感器使用20667第6期范增杰,馬莉萍等:基于靜電沉積殼聚糖鉑納米顆粒復合膜構(gòu)建葡萄糖生物傳感器天后,響應電流仍保持在80%左右,這可能是由于殼聚糖具有良好的生物相容性,能夠很好的保持酶的活力。該傳感器不用時,懸于4的磷酸鹽上方保存。3結(jié)論研究表明:通過靜電沉積能夠?qū)⒑K納米顆粒的殼聚糖溶液組裝到電極表面,成膜后具有很好的化學穩(wěn)定性。通過戊二醛交聯(lián)的方式固定葡萄糖氧化酶,制得的葡萄糖傳感器能夠固定并保持酶的活性,該傳感器具有靈敏度高,響應迅速,穩(wěn)定性好等優(yōu)點。傳感器的制作簡單,使用方便。參考文獻:1Pei J H,F Tian,T Thun

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