舒肝健脾補(bǔ)腎方對(duì)慢性應(yīng)激肝郁模型妊娠大鼠、胎鼠宮內(nèi)發(fā)育的干預(yù)

1、舒肝健脾補(bǔ)腎方對(duì)慢性應(yīng)激肝郁模型妊娠大鼠、胎鼠宮內(nèi)發(fā)育的干預(yù)作用(1)                       作者：朱姝，王希浩，張愛(ài)華，黃保民【摘要】  目的研究舒肝健脾補(bǔ)腎中藥對(duì)慢性應(yīng)激肝郁模型孕鼠血清P、IGF-1、IGF-2、子宮蛻膜PR水平及胎鼠、胎盤(pán)重量的影響，探討肝郁影響生殖功能的機(jī)理及舒肝健脾補(bǔ)腎中藥的作用機(jī)理。方法復(fù)制孕鼠慢性應(yīng)激肝郁模型，將6

2、0只孕鼠隨機(jī)分為5組：正常組、模型組、舒肝健脾補(bǔ)腎高組、舒肝健脾補(bǔ)腎低組、滋腎育胎丸組。孕19 d剖宮取胎，放射免疫法測(cè)定孕鼠血清P、IGF-1、IGF-2的含量，用免疫組化法檢測(cè)子宮蛻膜PR水平。結(jié)果模型組孕鼠血清P、IGF-1、IGF-2、子宮蛻膜PR水平及胎鼠、胎盤(pán)重量較正常組明顯降低(P0.01)。舒肝健脾補(bǔ)腎高組血清P、IGF-1、IGF-2、子宮蛻膜PR水平及胎鼠、胎盤(pán)重量明顯高于模型組(P0.01)。舒肝健脾補(bǔ)腎低組與與模型組相比無(wú)明顯差異(P0.05)。結(jié)論舒肝健脾補(bǔ)腎方能提高慢性應(yīng)激肝郁模型胎鼠、胎盤(pán)的重量。能提高孕鼠血清IGF-1、IGF-2的水平、P水平、子宮蛻膜PR水平

3、。研究結(jié)果為臨床運(yùn)用舒肝健脾補(bǔ)腎法治療肝郁型胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩提供了理論依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】  肝郁模型; 舒肝健脾補(bǔ)腎方; 胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩是指胎兒出生體重低于同孕齡胎兒平均體重的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差或第10百分位數(shù)，是圍產(chǎn)兒發(fā)病和死亡的主要危險(xiǎn)因素之一,還可影響兒童期和青年期發(fā)育，影響人口素質(zhì)1。胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩應(yīng)屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)的“胎萎不長(zhǎng)”“胎不長(zhǎng)”“妊娠胎萎燥”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝主疏泄，調(diào)暢情志。情志不遂，疏泄失職，致肝氣郁結(jié)，而肝氣郁結(jié)可致氣滯、血淤、痰濕，可影響脾腎功能，導(dǎo)致肝脾腎同病，胎失所養(yǎng)，胎萎不長(zhǎng)。本研究通過(guò)建立妊娠大鼠慢性應(yīng)激肝郁動(dòng)物模型，并以舒肝健脾補(bǔ)腎方藥進(jìn)行

4、干預(yù)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察孕鼠的自主行為，測(cè)定P、IGF-1、IGF-2、子宮蛻膜PR水平、胎鼠體重、胎盤(pán)重量，從中醫(yī)肝郁角度探討胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩的機(jī)理，研究舒肝健脾補(bǔ)腎中藥對(duì)慢性應(yīng)激肝郁狀態(tài)下妊娠大鼠及胎兒宮內(nèi)發(fā)育的影響，從而揭示肝郁影響生殖功能的機(jī)理及舒肝健脾補(bǔ)腎中藥的作用機(jī)理。1 材料與儀器1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組Wistar雌性大鼠60只，體質(zhì)量(240±30)g(購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。按21比例雌雄鼠合籠。每天進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，直到見(jiàn)到大量云片狀上皮細(xì)胞中夾有大量精子作為妊娠第1天。將孕鼠隨機(jī)分為5組：即正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱正常組)、模型對(duì)照組(簡(jiǎn)稱模型組)、舒肝健脾補(bǔ)腎高劑量

5、組(簡(jiǎn)稱舒肝健脾補(bǔ)腎高組)和舒肝健脾補(bǔ)腎低劑量組(簡(jiǎn)稱舒肝健脾補(bǔ)腎低組)、滋腎育胎丸組(簡(jiǎn)稱陽(yáng)性藥組)，每組12只。1.2 藥材按原方劑量40倍取材制劑。舒肝健脾補(bǔ)腎方：柴胡360 g，制香附360 g，生白芍600 g，蘇梗360 g，黃芩360 g，黨參600 g，炒白術(shù)600 g，熟地1200g，杞子600 g，生山藥1 200 g，菟絲子1200g，川斷480 g，寄生480 g。滋腎育胎丸：購(gòu)自廣州中一藥業(yè)有限公司。國(guó)藥準(zhǔn)字Z44120018，批號(hào)：070806。所得制劑濃度分別相當(dāng)于生藥含量的3.82，0.242 g/ml，由河南省中醫(yī)藥研究院制劑室提供。批號(hào)：20070810。1

6、.3 試劑及器材P、IGF-1放免試劑盒(購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)。IGF-2放免試劑盒(購(gòu)自解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免研究所提供)。敞箱(自制)：高為50 cm，長(zhǎng)寬均為80 cm,周壁為黑色，底面用白線劃分為面積相等的25塊。束縛筒(自制)：束縛筒直徑為6 cm，長(zhǎng)為16 cm。制動(dòng)箱(自制)：長(zhǎng)為40 cm，寬為30 cm，高為30 cm。程控穿梭箱：DCS-2，醫(yī)科院藥研所制。電子秤：EB-2800M，LIBROR。離心沉淀機(jī)：LXJ-II，上海醫(yī)用分析儀器廠。石蠟切片機(jī)：Leit2，德國(guó)。攤片烤片機(jī)：HG3003-3，南京電器三廠制造。微波爐：格蘭仕，800W。光學(xué)顯微鏡

7、：GALEN-II3696，BAUSCH LOMB。雙目顯微鏡(自動(dòng)照相)：BHA，日本。全自動(dòng)-放射免疫計(jì)數(shù)器：FJ-20089，南京。2 方法2.1 動(dòng)物模型的建立 按文獻(xiàn)法25，對(duì)模型組及藥物干預(yù)組孕鼠進(jìn)行慢性心理應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。孕鼠接受的應(yīng)激包括：(1)束縛筒束縛，2h/次，3次/d。(2)程控穿梭箱聲-電刺激，刺激參數(shù)為聲：強(qiáng)度為65 dB，每循環(huán)持續(xù)60 s，3循環(huán)/次，9循環(huán)/d;電：足底電擊電流強(qiáng)度為3 mA，每循環(huán)持續(xù)65 s，3循環(huán)/次，9循環(huán)/d。連續(xù)刺激至動(dòng)物處死，應(yīng)激實(shí)驗(yàn)環(huán)境與飼養(yǎng)環(huán)境分開(kāi)，正常組孕鼠不給予刺激，孕鼠受刺激后出現(xiàn)尖叫、直立、撓腮、撕咬、蜷縮、飲食減少、大便稀

8、薄、體重下降，提示肝郁模型建立。2.2 給藥劑量與方法正常組給予蒸餾水灌胃，10 ml/kg，1次/d,連續(xù)18 d。模型組造模后給予蒸餾水灌胃，10 ml/kg，1次/d，連續(xù)18 d。舒肝健脾補(bǔ)腎高劑量組造模后給予舒肝健脾補(bǔ)腎方浸膏稀釋液灌胃，13.12 g/ kg·d，相當(dāng)于成人劑量的13.4倍，10 ml/kg，1次/d，連續(xù)18天。舒肝健脾補(bǔ)腎低劑量組造模后給與舒肝健脾補(bǔ)腎方浸膏稀釋液灌胃，6.56 g/k g·d，相當(dāng)于成人劑量的6.7倍，10 ml/kg，1次/d，連續(xù)18d。滋腎育胎丸組：造模后常規(guī)飼養(yǎng),給予滋腎育胎丸稀釋液灌胃，2.42 g/ kg

9、3;d，相當(dāng)于成人劑量的13.4倍，10 ml/kg，1次/d，連續(xù)18 d。2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料結(jié)果以±s描述;符合正態(tài)分布計(jì)量資料多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的采用對(duì)數(shù)法或倒數(shù)法進(jìn)行轉(zhuǎn)換為正態(tài)資料后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)用等級(jí)頻數(shù)資料分析。本篇論文由網(wǎng)友投稿，讀書(shū)人只給大家提供一個(gè)交流平臺(tái)，請(qǐng)大家參考，如有版權(quán)問(wèn)題請(qǐng)聯(lián)系我們盡快處理。3 結(jié)果3.1 舒肝健脾補(bǔ)腎方對(duì)慢性應(yīng)激肝郁模型孕鼠自主活動(dòng)的影響結(jié)果見(jiàn)表1。表1 各組孕鼠敞箱試驗(yàn)中穿越格數(shù)及直立次數(shù)的影

10、響結(jié)果顯示造模前各組孕鼠穿越格數(shù)經(jīng)F檢驗(yàn)得，F(xiàn)=0.668，P=0.617>0.05，提示造模前各組差別均無(wú)意義，具有可比性。造模后舒肝健脾補(bǔ)腎高、低組及陽(yáng)性藥組孕鼠穿越格數(shù)顯著低于模型組(P<0.01)。正常組孕鼠穿越格數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)。造模前各組孕鼠直立次數(shù)經(jīng)F檢驗(yàn)得，F(xiàn)=0.884，P=0.481>0.05，提示造模前各組差別均無(wú)意義，具有可比性。造模后正常組、舒肝健脾補(bǔ)腎低組孕鼠直立次數(shù)低于模型組(P<0.05);舒肝健脾補(bǔ)腎高組及陽(yáng)性藥組孕鼠直立次數(shù)低于模型組(P<0.01)。3.2 舒肝健脾補(bǔ)腎方對(duì)慢性應(yīng)激肝郁模型孕鼠血清IGF-

11、1、IGF-2水平的影響結(jié)果見(jiàn)表23。3.3 舒肝健脾補(bǔ)腎方對(duì)慢性應(yīng)激肝郁模型胎鼠體重、胎盤(pán)重量的影響結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示模型組孕鼠血清IGF-1、IGF-2較正常組明顯降低(P0.01)。舒肝健脾補(bǔ)腎高組及陽(yáng)性藥組血清IGF-1、IGF-2明顯高于模型組(P0.05)。舒肝健脾補(bǔ)腎低組與模型組相比無(wú)明顯差異(P0.05)。表2 舒肝健脾補(bǔ)腎方對(duì)孕鼠血清IGF-1的影響表3 舒肝健脾補(bǔ)腎方對(duì)孕鼠血清IGF-2的影響表4 各組胎鼠的體重、胎盤(pán)重量比較結(jié)果顯示模型組胎鼠體重、胎盤(pán)重量顯著低于正常組(P<0.01);舒肝健脾補(bǔ)腎高組及陽(yáng)性藥組胎鼠體重、胎盤(pán)重量重量顯著高于模型組(P<0.

12、01);舒肝健脾補(bǔ)腎低組胎鼠體重、胎盤(pán)重量與模型組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。3.4 舒肝健脾補(bǔ)腎方對(duì)慢性應(yīng)激肝郁模型孕鼠血清P水平的影響結(jié)果見(jiàn)表5。表5 舒肝健脾補(bǔ)腎方對(duì)孕鼠血清P水平的影響結(jié)果顯示模型組孕鼠血清P水平顯著低于正常組(P<0.05);舒肝健脾補(bǔ)腎高組孕鼠血清P水平顯著高于模型組(P<0.01);陽(yáng)性藥組孕鼠血清P水平高于模型組(P<0.05)，舒肝健脾補(bǔ)腎高組優(yōu)于陽(yáng)性藥組，舒肝健脾補(bǔ)腎低組血清P水平顯著高于模型組(P<0.05)。3.5 舒肝健脾補(bǔ)腎方對(duì)慢性應(yīng)激肝郁模型孕鼠子宮蛻膜的PR水平的影響結(jié)果見(jiàn)表6。表6 舒肝健脾補(bǔ)腎方對(duì)孕鼠子宮蛻膜

13、的PR水平的影響結(jié)果顯示模型組孕鼠子宮蛻膜的PR水平顯著低于正常組(P<0.01);舒肝健脾補(bǔ)腎高組孕鼠子宮蛻膜的PR水平顯著高于模型組(P<0.01);陽(yáng)性藥組孕鼠子宮蛻膜的PR水平顯著高于模型組(P<0.05)。4 討論妊娠期間陰血不足，氣易偏盛的特點(diǎn)，正常妊娠就易導(dǎo)致陰虧、氣滯、痰飲的產(chǎn)生，而肝郁更易加重氣滯，導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。正常的妊娠需要?dú)庋淖甜B(yǎng)及脾腎的固攝，肝郁可致氣滯血淤，氣血運(yùn)行受阻;肝郁可橫逆犯脾，影響脾的生化功能使氣血生化不足，影響脾的運(yùn)化功能，使水濕、痰飲病理產(chǎn)物產(chǎn)生，氣血運(yùn)行受阻，此外還可影響到脾的升清固攝功能，使氣血不能正常的運(yùn)行;肝郁可導(dǎo)致腎的封藏

14、功能失常，沖任不固;肝郁日久，耗血傷精，肝腎精血不足，沖任不充，若肝郁化火，熱傷沖任，暗耗陰血。因此肝郁可引起脾腎功能異常，導(dǎo)致肝脾腎同病，胎失所養(yǎng)，引起胎萎不長(zhǎng)、胎動(dòng)不安、胎漏。治療肝郁導(dǎo)致宮內(nèi)發(fā)育遲緩時(shí)，運(yùn)用疏肝藥時(shí)要注意妊娠“陰血不足，陽(yáng)氣偏亢”的特點(diǎn)，疏肝理氣藥用量不易過(guò)重，不宜用過(guò)多香燥理氣之品，以免暗耗陰血，遵循“養(yǎng)其血，舒其郁，順其性，柔其體，以柔為法”的法則，要疏肝柔肝和胃、理氣安胎 。但不能單用疏肝藥，同時(shí)要考慮到妊娠病的特點(diǎn)、與脾腎的關(guān)系以及肝郁影響脾腎功能的特點(diǎn)，疏肝的同時(shí)要健脾補(bǔ)腎安胎、養(yǎng)胎，健脾補(bǔ)腎安胎藥用量易大，藥味易多，達(dá)到理氣不傷正，滋陰不滋膩，使沖任充足固護(hù)，

15、胎孕正常。這正是舒肝健脾補(bǔ)腎方組方原則。胎鼠、胎盤(pán)的重量反映了胎鼠在宮內(nèi)發(fā)育的情況，實(shí)驗(yàn)表明慢性應(yīng)激肝郁狀態(tài)下胎鼠、胎盤(pán)的重量下降，從而造成IUGR。舒肝健脾補(bǔ)腎方能使慢性應(yīng)激肝郁模型胎鼠、胎盤(pán)的重量增加，這反映了該方能改善胎鼠在宮內(nèi)發(fā)育的環(huán)境，促進(jìn)胎鼠全身各器官的發(fā)育，從而使胎鼠、胎盤(pán)的重量增加。IGF-1、 IGF-2是胎兒生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)因子，是維持胎兒生長(zhǎng)是必需的因子。IGF-1主要是促進(jìn)胎兒器官成熟，IGF-2主要調(diào)節(jié)胎兒、胎盤(pán)的生長(zhǎng)發(fā)育。孕婦血清中的IGF-1、 IGF-2不經(jīng)過(guò)胎盤(pán)屏障，但可通過(guò)調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)胎盤(pán)供給胎兒，增加胎兒的分泌及生物利用度，從而促進(jìn)胎兒的正常發(fā)育9。研究已

16、證實(shí)，無(wú)論胎兒 IUGR是由宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不良或缺氧或胎盤(pán)功能異常所致，均首先通過(guò)降低IGF-1、 IGF-2，從而使各型細(xì)胞分裂、分化、增殖、成熟或存活的能力以及組織器官對(duì)葡萄糖攝取和氧化及對(duì)氨基酸攝取的能力降低 ,細(xì)胞分裂周期延長(zhǎng)、數(shù)量減少、功能障礙 ,最終導(dǎo)致其生長(zhǎng)發(fā)育遲緩10。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明舒肝健脾補(bǔ)腎方能提高慢性應(yīng)激肝郁模型孕鼠血清IGF-1、IGF-2水平，從而促進(jìn)胎鼠的正常發(fā)育。P對(duì)受精卵的種植和妊娠的維持有非常重要的作用，實(shí)驗(yàn)證明舒肝健脾補(bǔ)腎方能提高慢性應(yīng)激肝郁模型孕鼠血清P的含量。而P作用的強(qiáng)弱取決于激素水平和靶細(xì)胞激素受體的含量、特異性及親和力11。PR水平的降低使P缺少有效的靶點(diǎn)難以發(fā)揮激素樣作用導(dǎo)致胎兒不能正常發(fā)育。實(shí)驗(yàn)表明舒肝健脾補(bǔ)腎方通過(guò)顯著增加孕鼠子宮蛻膜的PR的含量，并增強(qiáng)其對(duì)孕激素的敏感性，使得孕激素與孕激素受體相結(jié)合，充分發(fā)揮孕激素的生物效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)性腺軸的激素-激素受體的調(diào)節(jié)。動(dòng)物的情緒改變可以通過(guò)觀察大鼠的行為來(lái)間接感知，敞箱試驗(yàn)是最常用于測(cè)定大鼠情緒、心理狀態(tài)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，能以量化的指標(biāo)客觀反映大鼠的焦慮程度以及對(duì)外界、未知的探究欲望，從而提示受試大鼠的情緒、心理狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)：慢性應(yīng)激刺激孕鼠處于心理應(yīng)激狀態(tài)，并表現(xiàn)出情緒煩躁不安和焦慮狀態(tài)。舒肝健脾補(bǔ)腎方能