生化實(shí)驗_轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性的測定報告

1、實(shí)驗二（2）轉(zhuǎn)氨幅（GPT活性的測定1 研究背景及目的轉(zhuǎn)氨酶是生物體內(nèi)重要的一類酶。轉(zhuǎn)氨酶催化a -氨基酸的氨基與a -酮酸的酮基之間的相互轉(zhuǎn)化而生成一種新的氨基酸與一種的新的酮酸，這種作用被稱為轉(zhuǎn)氨基作用1。轉(zhuǎn)氨酶種類很多，體內(nèi)除了賴氨酸、蘇氨酸外，其余a-氨基酸都可參加轉(zhuǎn)氨基作用并各有其特異的轉(zhuǎn)氨酶。其中以谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ GPT和谷草 轉(zhuǎn)氨酶（GOT最為重要。GPT與GOT舌性的測定在臨床上有著重要應(yīng)用，可作 為一些疾病診斷的指標(biāo)。GPT崔化的是谷氨酸與丙酮酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，GOT崔化的是谷氨酸與草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，草酰乙酸在檸檬酸苯胺溶液中可以轉(zhuǎn)變?yōu)楸崤c二氧化碳。由于都有丙酮酸的生

2、成，所以可以通過實(shí)驗測定一定時間內(nèi)丙酮酸的生成量而計算這兩種轉(zhuǎn)氨酶的活性。本實(shí)驗以動物的新鮮肝臟和血清為材料，分別測定其中的GTP的活性，以此來研究該轉(zhuǎn)氨酶活性的測定方法。2 原理由于動物肝臟和血清中的轉(zhuǎn)氨酶活性較高，易于測得，且動物或人的轉(zhuǎn)氨酶活性的測定應(yīng)用廣泛、技術(shù)成熟，因此本試驗選取家兔的新鮮肝臟和血清為實(shí)驗材料，對其中的一種重要轉(zhuǎn)氨酶一一 GTP的活性進(jìn)行測定。轉(zhuǎn)氨酶活性測定的歷史沿革建立了金氏法、穆氏法及賴氏法等較成熟的基本方法，本實(shí)驗采用的是金氏法。該方法對轉(zhuǎn)氨酶活力的定義是：血清在37，pH7.4 條件下，與底物作用60min后，每生成1仙M丙酮酸為一個轉(zhuǎn)氨酶活性單位。丙酮酸含量

3、的測定運(yùn)用的是比色法。丙酮酸可與2,4- 二硝基苯肼反應(yīng)，生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，所以通過測定溶液在520nm下的光吸收值并與標(biāo)準(zhǔn)溶液比色 便可計算出丙酮酸的含量，丙酮酸的含量對應(yīng)于一定的轉(zhuǎn)氨酶活力單位。3 材料、試劑與儀器材料 ：新鮮家兔肝臟和血清試劑1： 磷酸鹽緩沖液（pH7.4）甲液：1/15 mol/L 磷酸氫二鈉溶液乙液：1/15 mol/L 磷酸氫二鉀溶液取甲液825ml,乙液175ml,混合，測得pH為7.4即可GTP基質(zhì)液稱取a -酮戊二酸29.2mg及DL-丙氨酸1.78g ,溶于pH7.4的磷酸鹽緩沖液20ml 中，再加緩沖液70ml,并移入100ml容

4、量瓶中，加1mol/L的氫氧化鈉溶液0.5ml, 校正pH 至 7.4，再以 pH7.4 的磷酸鹽緩沖液定容。貯存于冰箱中備用，可保存一周時間。 2,4- 硝基苯肼溶液稱取2,4二硝基苯肥20mg先?于10ml濃鹽酸中，再以蒸儲水稀釋至 100ml, 棕色試劑瓶內(nèi)保存。 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液精確稱取丙酮酸鈉22mg溶解后轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液定容即可。 檸檬酸苯胺溶液取檸檬酸50g 溶于 50ml 蒸餾水中，再加苯胺充分混合即可，低溫出現(xiàn)結(jié)晶時，可置于37水浴中溶解后應(yīng)用。 0.4M 氫氧化鈉溶液 儀器 ：DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司，編號L304

5、056）TPL-4OB1氐溫臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，編號20070529）722 光柵分光光度計（上海緊密科學(xué)儀器有限公司）大龍系列加樣器及吸頭（20-200屋，100-1000 l , 1000-5000以）JP-100 架盤藥物天平（美國雙杰兄弟有限公司，編號3878）配平天平（北京醫(yī)用天平廠）刻度試管，離心管，小燒杯，勻漿器，洗瓶，冰浴操作步驟1 取 健康家兔，處死。心臟采血，分裝至離心管（生理鹽水浸潤）， 4000 轉(zhuǎn)低溫離心15min,取上清液冰浴待用。取肝臟，生理鹽水沖洗瀝干，取1g勻漿， 用磷酸鹽緩沖液定容至10ml, 4000轉(zhuǎn)低溫離心15min,取上清液，冰浴，記 為

6、肝臟研磨液1。取2ml肝臟研磨液1,用磷酸鹽緩沖液定容至4ml,冰浴， 記為肝臟研磨液2。2 取 6 支試管，編號，按下表操作1管號123456內(nèi)酮限標(biāo)準(zhǔn)液00.050.100.150.200.25GPI底物0.500.450. 400.350.300.25磷酸鹽緩沖液0.10.10.10.10.10.1再取18支試管，分為三組，每組6支，分別用于測定血清、肝臟研磨液 1、 肝臟研磨液2的GPT舌性，6支試管中3支作為測定管，另外3支作為對照管。 按下表操作：試劑（單位ml）測定管對照管血清或肝臟勻漿液0.10.137 c 水浴 5minGPI底物0.5將完成以上操作的24支試管按下表操作:3

7、7 c 水浴 30min各管加入2,4-二硝基苯肥0.5ml9支對照管中各加入GPTK物0.5ml37 c 水浴 20min各管力口入 0.4M NaOH5.0ml10min后從水浴中取出各試管，待冷卻至室溫，520nm下比色，記錄消光值五.數(shù)據(jù)整理1.標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)于谷丙轉(zhuǎn)氨酶單位0285797150200OD52000.0980. 1750. 2510.3000.358標(biāo)準(zhǔn)曲線2. GPT活性測定2.1血清中GPT舌性的測定六.結(jié)果計算與分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0017x+0.0464 （y對應(yīng)于ODfi, x對應(yīng)于酶活單位）計算各三種樣品光吸收值（以測定管均值與對照管均值之差計算）對應(yīng)

8、的酶活單位，結(jié)果匯總?cè)缦?樣品血清肝臟研磨液1肝臟研磨液2GPT舌性單位36.8234.5214.5以上結(jié)果顯示：血清中GPT舌性較高，而肝臟中的GPT舌性特別的高，盡管 稀釋了一定的倍數(shù)，仍然超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定的范圍。 我們知道，研磨液2是由 研磨液1稀釋2倍得到的，但是其活性完全與稀釋倍數(shù)不成比例。 我認(rèn)為這是由 兩個方面的原因造成的：肝臟中GPT舌性過高，催化反應(yīng)中GPT量，其活性 沒有得到完全的體現(xiàn)，所以稀釋后活性沒有按稀釋倍數(shù)降低；肝臟研磨液稀釋 倍數(shù)不夠，使得產(chǎn)物濃度超出了比色法的線性范圍， 最終導(dǎo)致通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 計算得到的酶活單位存在較大誤差。七.結(jié)論與展望通過以上的計算與分

9、析，本實(shí)驗得到的結(jié)論是：通過比色法測定一定時間內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物的含量來表征轉(zhuǎn)氨酶的活性的方法是可行的，關(guān)鍵的問題在于如何確定底物及酶的濃度從而使得酶的活性得到最大程度的發(fā)揮且底物濃度適于比色法的測定。本實(shí)驗中由于肝臟中轉(zhuǎn)氨酶活性過高，稀釋倍數(shù)不夠，導(dǎo)致產(chǎn)物濃度過大，超出了比色法的最適測定范圍，得到的數(shù)據(jù)誤差較大。所以希望以后的實(shí)驗?zāi)軌蛘{(diào)整肝臟研磨液的稀釋倍數(shù)，更加準(zhǔn)確地測定轉(zhuǎn)氨酶的活性。8 實(shí)驗小結(jié)本次實(shí)驗比較成功，實(shí)驗過程中沒有出現(xiàn)明顯失誤。由于實(shí)驗室配備了加樣器取代了原來的移液管，使得加樣速度大大提高，最終我們小組在較短時間內(nèi)順利完成了實(shí)驗。此外從實(shí)驗數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)：各平行實(shí)驗數(shù)據(jù)相差

10、較小，可見平行性良好，實(shí)驗操作帶來的偶然誤差較小。9 參考文獻(xiàn)1 生物化學(xué)實(shí)驗指導(dǎo)19-22 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗室中國農(nóng)業(yè)大學(xué)自編教材附：兩種酶活性測定實(shí)驗的主要設(shè)計細(xì)節(jié)異同點(diǎn)分析比較：淀粉酶與轉(zhuǎn)氨酶活性的測定在實(shí)驗的整體思路上是相同的，但是實(shí)驗設(shè)計上存在著許多不同之處，各自具有其特點(diǎn)，具體表現(xiàn)為以下幾點(diǎn)：首先， 制備酶液的方法不同：淀粉酶活性測定中采用的是萌發(fā)的小麥種子的研磨稀釋液，轉(zhuǎn)氨酶活性的測定中采用的是家兔的血清及肝臟研磨稀釋液。作如此選擇是出于實(shí)驗的可操作性及現(xiàn)實(shí)意義的考慮。萌發(fā)的種子中的淀粉酶活性和動物血清及肝臟中的轉(zhuǎn)氨酶活性都比較高，所以選取它們易于較準(zhǔn)確地測得酶活性；此外

11、，萌發(fā)的種子中淀粉酶活性的測定對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義，而動物或人的血清及肝臟中轉(zhuǎn)氨酶活性的測定在臨床上具有重要應(yīng)用，所以以它們?yōu)閷?shí)驗材料的研究在技術(shù)上比較成熟而且具有現(xiàn)實(shí)意義。第二，淀粉酶活性測定實(shí)驗是以兩種淀粉酶一一a淀粉酶和B淀粉酶為研究 對象的，而轉(zhuǎn)氨酶活性測定實(shí)驗是以一種轉(zhuǎn)氨酶 GPT為研究對象的。也就是說， 淀粉酶活性測定實(shí)驗以一種生物材料來研究兩種淀粉酶的活性而轉(zhuǎn)氨酶活性測定實(shí)驗以兩種生物材料來研究一種轉(zhuǎn)氨酶的活性。具體的實(shí)現(xiàn)測定的策略分別是：淀粉酶活性測定實(shí)驗分別測定a淀粉酶 （抑制了 B淀粉酶活性）活性及兩種 淀粉酶的總活性；轉(zhuǎn)氨酶活性測定實(shí)驗分別測定了血清中的 GPT

12、活性及兩種不同 稀釋倍數(shù)的肝臟研磨液的 GPT舌性。如此設(shè)計主要出于兩方面的考慮：實(shí)驗的可 操作性及典型性。因為對于淀粉酶的測定，通過抑制B淀粉酶活性來測定a淀粉 酶活性是易于實(shí)現(xiàn)的；而對于轉(zhuǎn)氨酶活性的測定，GP說一種體內(nèi)最重要的轉(zhuǎn)氨酶之一，所以其活性測定具有典型性，通過測定GPTS不同組織中的活性能夠?qū)?現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶活性研究的目的。第三， 酶活性的測定是通過酶促反應(yīng)的產(chǎn)物測定實(shí)現(xiàn)的，淀粉酶活性測定實(shí)驗中測定的產(chǎn)物是麥芽糖，這是因為兩種淀粉酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物幾乎都是麥芽糖， 所以麥芽糖的產(chǎn)量能夠表征淀粉酶的活性，而且麥芽糖的含量易于通過比色法測得； 同樣道理，轉(zhuǎn)氨酶活性測定實(shí)驗中測定的是催化產(chǎn)物中的

13、丙酮酸的含量。第四， 酶活力單位的定義不同：淀粉酶活力單位的定義是：每分鐘每克鮮重麥種所催化生成的麥芽糖毫克數(shù)；轉(zhuǎn)氨酶活力單位的定義是：血清 （或肝臟研磨液）在37 C, pH7.4條件下，與底物作用60min生成1仙M丙酮酸為一個轉(zhuǎn)氨酶 活力單位。第五，酶促反應(yīng)的條件不同，主要表現(xiàn)在溫度的不同：淀粉酶的反應(yīng)是在40下進(jìn)行的，而轉(zhuǎn)氨酶的反應(yīng)在37。這是由于這兩種酶的最適溫度不同，淀粉酶的最適溫度是40而轉(zhuǎn)氨酶的最適溫度是37，由于酶活性的測定要求在“最適條件下”測定，所以設(shè)定這樣的反應(yīng)溫度。第六，酶促反應(yīng)的時間不同：淀粉酶活性測定的反應(yīng)時間為準(zhǔn)確的5 分鐘，而轉(zhuǎn)氨酶活性測定的反應(yīng)時間是 30m

14、in。這是由這兩種酶促反應(yīng)的特點(diǎn)決定的：淀粉酶催化的反應(yīng)快速靈敏，在較短時間內(nèi)完成；而轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)屬于可逆反應(yīng)，反應(yīng)速率較慢，需要較長的時間反應(yīng)才能夠建立平衡。第七， 酶活力測定的要求之一是保證測定的是反應(yīng)的初速度，那么這兩個實(shí)驗分別是如何實(shí)現(xiàn)的呢？淀粉酶活性測定實(shí)驗中通過制備低濃度酶液以及控制短時間的反應(yīng)來保證反應(yīng)的初速度；轉(zhuǎn)氨酶活性測定實(shí)驗中則通過底物濃度的設(shè)定來保證反應(yīng)的初速度。這是基于這兩種酶促反應(yīng)動力學(xué)特性來設(shè)計的：淀粉酶的催化反應(yīng)在短時間內(nèi)完成，酶活性很高，所以要求以低濃度的酶液在短時間內(nèi)反應(yīng)； 轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)屬于雙底物可逆反應(yīng)，反應(yīng)速率較低，所以通過設(shè)定過量的底物以及合理配

15、制兩種底物的比例即可保證反應(yīng)的初速度。第八， 實(shí)驗整體的復(fù)雜度不同：綜合來看，轉(zhuǎn)氨酶活性測定實(shí)驗的復(fù)雜度較淀粉酶活性測定實(shí)驗的高。這是因為：轉(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)的機(jī)理較淀粉酶的復(fù)雜。前者為雙底物可逆酶促反應(yīng)，后者為單一底物的不可逆酶促反應(yīng)?？梢娹D(zhuǎn)氨酶活性測定的實(shí)驗的干擾因素比較復(fù)雜，其底物濃度及兩種底物濃度比等也成了實(shí)驗的影響因素。此外轉(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)的可逆性決定了只能測定原始的產(chǎn)物濃度而不能像淀粉酶活性測定實(shí)驗?zāi)菢訉a(chǎn)物經(jīng)過稀釋等處理后再進(jìn)行測定，這就使得測定的酶液濃度受到嚴(yán)格的限制，因為比色法測定底物濃度的范圍是受到限制的。實(shí)驗材料不同。轉(zhuǎn)氨酶活性測定實(shí)驗采用的是動物的血清和肝臟而淀粉酶活性測定實(shí)

16、驗采用的是植物萌發(fā)的種子。顯然動物材料較難獲取且酶液的制備較麻煩，更重要的是，動物不同個體的器官或組織甚至同一器官或組織的不同部位的轉(zhuǎn)氨酶活性存在較大差異，因此制備酶液時的稀釋倍數(shù)較難確定，一般需要通過先行實(shí)驗才能確定；而相同條件下萌發(fā)的種子的淀粉酶活性比較一致，酶液的配制可以根據(jù)實(shí)驗經(jīng)驗進(jìn)行。最后， 實(shí)驗設(shè)計整體的嚴(yán)謹(jǐn)性不同：淀粉酶活性測定實(shí)驗的設(shè)計較轉(zhuǎn)氨酶活性測定實(shí)驗的嚴(yán)謹(jǐn)。這是由實(shí)驗整體的復(fù)雜度決定的，既然淀粉酶活性測定實(shí)驗復(fù)雜度較低，那么就容易做到設(shè)計上的嚴(yán)謹(jǐn)。首先，由于反應(yīng)速率較快，所以設(shè)定準(zhǔn)確反應(yīng)時間5min,并通過強(qiáng)堿溶液立刻停止酶促反應(yīng)。另外，在測定產(chǎn)物濃度時， 先使產(chǎn)物在高溫下發(fā)生顏色反應(yīng)，然后稀釋至適宜的濃度通過比色法