氨基酸的分離鑒定—紙層析法

1、氨基酸的分離鑒定一紙層析法作者:日期:化學與生物工程學院生物工程系生物化學實驗報告課程名稱:生物化學實驗項th氨基酸的分離鑒怎一紙析法實驗室名:生物化學實驗室實驗時間:2012-11-15楊艷任課老師:專業(yè)班級:生物工程1142學生姓名:髙曄學號:20H21030219 組別:第五組實驗內(nèi)容【實驗目的】通過氨基酸的分離，學習紙層析法的基本原理，掌握氨基酸紙層析的操作方法?！緦嶒炘怼康浆F(xiàn)在為止，紙層 抗生素等物質(zhì)的一紙層析法（paper chromatography）通常用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的企性和定量。1944 年A. J. P.馬丁第一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果。 析法已經(jīng)

2、成為是性或定雖測宦多肽，核酸堿基，糖，有機酸，維生素， 種最簡單易行的分離分析工具?？勺鲭p向?qū)游觥層析用于分析簡單的混合物時可做單向?qū)游?。對于復雜的混合物， 原理是以濾紙為惰性支持物的分配層析，層析溶劑由有機溶劑和水組成。濾紙纖維上的疑 基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機溶劑為流動相。當有機相流經(jīng)固立相時，由 于分配系數(shù)不同，結(jié)果物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。其一般操作是將樣品溶解在適當溶劑中，點樣在濾紙的一端：再選用適當?shù)娜軇┫到y(tǒng), 從點樣的一端通過毛細現(xiàn)象向另一端展開，展開完,取出濾紙晾丁或烘干，再以適當?shù)?顯色劑或紫外燈、熒光燈下觀察其圖譜。樣品經(jīng)展開后某一物質(zhì)在紙層析譜上的位

3、置常用 比移值（rale of folw. R（）來表示。Rr=原點至層析斑點中心的距離/原點至溶劑前沿的距離 =X/Y在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與被測物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑 系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實驗利用單向紙層析法分離訊基酸。【實驗器材】1器材層析缸、毛細管、小燒杯、量筒、培養(yǎng)皿、分液漏斗、層析濾紙（新華一號）、噴霧器（或 白瓷盤人烘箱（或吹風機）、鉛筆、直尺2試劑1）、擴展劑 40mL 將20mL水飽和的正丁醇和5mL酣酸以體積比4： 1在分液漏斗中進行混合。然后與15mL蒸水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取漏 斗內(nèi)的擴展劑約5mL

4、置于小燒杯中做平衡溶劑其余的倒人培養(yǎng)皿中備用。2）、氨基酸溶液0. 5%的賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液（各組份濃度均為05%）各配置5mL °3）、顯色劑 50lOOmL 01%水合葩三酮正丁醇溶液?！緦嶒灢襟E】（1）檢查培養(yǎng)皿是否T燥、潔凈：若否，將其洗凈并置于干燥箱內(nèi)1209烘干。（2）平衡：剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把 盛有約5mL展層溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或大饒杯中，用塑料薄膜密封起來，平衡 20min在B線上以A、（3）規(guī)劃：帶上手套，取寬約10cm、高約15cm的層析濾紙一張。在紙的下端距邊緣2 3 cm處輕輕用鉛筆

5、劃一條平行于底邊的直線A,在直線上做4個記號，記號之間間隔2cm. 這就是原點的位置。另在距左邊緣1cm處畫一條平行于左邊緣的直線B,B16n、S0 ,A¥一1丨【.！L1* rtCl/兒IB兩線的交點為原點標明刻度（以厘米為單位），參見下圖。圖2實驗裝置示意圖（4）點樣：用毛細管分別取lOmL左右的氨基酸樣品點在四個位置上。干后重復點樣， 同一位置上需點23次，23mL/次，保證每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm。其 中3個是已知樣，1個是待測樣品。（5）層析：用針、線將濾紙縫成簡狀，紙的兩側(cè)邊緣不能接觸且要保持平行，參見圖1-1。 向培養(yǎng)皿中加入擴展劑，使其液而高度達到1cm左

6、右，將點好樣的濾紙筒直立于培養(yǎng)皿中（點樣的一端在下，擴展劑的液面在A線下約1cm）.罩上大燒杯，仍用塑料薄膜密封。 當擴展劑上升到A線時開始計時，每隔一定時間測定一下擴展劑上升的高度，填入表1中。 當上升到1518cm,取岀濾紙，剪斷連線，立即用鉛筆描出溶劑前沿線，自然風干或用 電吹風熱風吹干。（6）顯色：用噴霧器在通鳳廚中向濾紙上均勻噴上0.1%苗三酮正丁醇溶液，然后置烘箱 中烘烤5分鐘（ioor）或用熱風吹丁即可顯出各層析斑點。（7）計算齊種氨基酸的礙值，并判斷混合樣品中都有哪些氨基酸，$人將自己的實驗結(jié) 果貼在實驗報告上，見表2。（8）以層析時間為橫坐標，擴展劑上升高度為縱坐標畫圖，求出

7、擴展劑上升到15cm時 所需要的時間?！緦嶒灲Y(jié)果與數(shù)據(jù)處理】表1擴展劑前沿上升速度X (min)0510152030406090Y (cm)008L52988815表2各種氨基酸的Rj值【實驗結(jié)論】通過實驗可以知道毎種氨基酸的在擴展劑中的移動速率是不相同的，利用每種氨基酸 在紙上的位置不同可以il算出氨基酸的Rf值。和標準的RC值對比，得出氨基酸種類。據(jù)此由上表2可知，混合氨基酸是由賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸組成。【注意事項】（1）點樣時要避免手指或唾液等污染濾紙有效面（即展層時樣品可能達到的部分）。（2）點樣斑點不能太大防止層析后氨基酸斑點過度擴散和重疊且點樣后吹風溫度不宜過高，以免樣品變性（斑點發(fā)黃）。（3）展層開始時切勿使樣品點浸入溶劑中。（4）展層劑要臨用前配制，以免發(fā)生酯化，影響層析結(jié)果。如果樣品中溶處種類較多，且某些溶質(zhì)在某一溶劑系統(tǒng)中的Rcm十分接近時，單 向?qū)游龇蛛x效果不佳，則可采用雙向?qū)游?，即將樣品點在一方形濾紙的角上，先用一種溶 劑系統(tǒng)展層。濾紙取出干燥后，再將濾紙轉(zhuǎn)90度角，用另一溶劑系統(tǒng)