蛋白的變性和復(fù)性

1、蛋白的變性和復(fù)性變性：蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是體現(xiàn)生物功能的基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)折疊則是形成空間結(jié)構(gòu)的過程。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的著名學(xué)說, 認(rèn)為蛋白質(zhì)折疊是受熱力學(xué)因素控制的. 天然蛋白質(zhì)處于能量最低(即熱力學(xué)最穩(wěn)定)的狀態(tài). 一般來說, 天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是相對(duì)穩(wěn)定的, 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也是其保持生物個(gè)體功能和物種的相對(duì)穩(wěn)定所要求的.蛋白質(zhì)擔(dān)負(fù)著復(fù)雜的生化反應(yīng), 同時(shí)在生物合成以后, 蛋白質(zhì)本身也經(jīng)歷著繁雜的生理過程. 蛋白質(zhì)自翻譯以后, 還需進(jìn)行一系列的翻譯后過程, 包括跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、修飾加工、折疊復(fù)性、生化反應(yīng)、生物降解等. 這些過程似乎都伴隨著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換, 不但受蛋白質(zhì)肽鏈自身的熱力學(xué)穩(wěn)定性所

2、控制, 而且還受動(dòng)力學(xué)過程控制.變性原因：蛋白質(zhì)因受某些物理或化學(xué)因素的影響，分子的空間構(gòu)象被破壞，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)發(fā)生改變并失去原有的生物學(xué)活性的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性作用（denaturation）。變性作用并不引起蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，而是二級(jí)結(jié)構(gòu)以上的高級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，變性后的蛋白質(zhì)稱為變性蛋白。引起蛋白質(zhì)變性的因素很多，物理因素有高溫、紫外線、X-射線、超聲波、高壓、劇烈的攪拌、震蕩等。化學(xué)因素有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、胍鹽、去污劑、重金屬鹽（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，濃乙醇等。不同蛋白質(zhì)對(duì)各種因素的敏感程度不同。蛋白質(zhì)變性后許多性質(zhì)都發(fā)生了改變，主要有以下幾個(gè)方面：（一）生

3、物活性喪失  蛋白質(zhì)的生物活性是指蛋白質(zhì)所具有的酶、激素、毒素、抗原與抗體、血紅蛋白的載氧能力等生物學(xué)功能。生物活性喪失是蛋白質(zhì)變性的主要特征。有時(shí)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)只有輕微變化即可引起生物活性的喪失。（二）某些理化性質(zhì)的改變   蛋白質(zhì)變性后理化性質(zhì)發(fā)生改變，如溶解度降低而產(chǎn)生沉淀，因?yàn)橛行┰瓉碓诜肿觾?nèi)部的疏水基團(tuán)由于結(jié)構(gòu)松散而暴露出來,分子的不對(duì)稱性增加，因此粘度增加，擴(kuò)散系數(shù)降低。（三）生物化學(xué)性質(zhì)的改變   蛋白質(zhì)變性后，分子結(jié)構(gòu)松散，不能形成結(jié)晶，易被蛋白酶水解。蛋白質(zhì)的變性作用主要是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)被破壞。天然蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

4、是通過氫鍵等次級(jí)鍵維持的，而變性后次級(jí)鍵被破壞，蛋白質(zhì)分子就從原來有序的卷曲的緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序的松散的伸展?fàn)罱Y(jié)構(gòu)（但一級(jí)結(jié)構(gòu)并未改變）。所以，原來處于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)大量暴露在分子表面，而親水基團(tuán)在表面的分布則相對(duì)減少，至使蛋白質(zhì)顆粒不能與水相溶而失去水膜，很容易引起分子間相互碰撞而聚集沉淀。復(fù)性：如果變性條件劇烈持久，蛋白質(zhì)的變性是不可逆的。如果變性條件不劇烈，這種變性作用是可逆的，說明蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化不大。這時(shí)，如果除去變性因素，在適當(dāng)條件下變性蛋白質(zhì)可恢復(fù)其天然構(gòu)象和生物活性，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性（renaturation）。外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成

5、，雖然包涵體具有富集目標(biāo)蛋白質(zhì)、抗蛋白酶、對(duì)宿主毒性小等優(yōu)點(diǎn)，但包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性率一般都很低, 一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。包涵體：包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。   一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，具有很高的密度（約1.3mg/ml），無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等一般的水溶液很難溶解包涵體，只有在變性劑溶液中才能很好溶解，這時(shí)，溶解的包涵體蛋白獲得完全變性，即除一級(jí)結(jié)

6、構(gòu)和共價(jià)件保留外，所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈全暴露。然后，在一定條件下除去變性劑促使產(chǎn)物蛋白完成正確的蛋白折疊過程，獲得天然結(jié)構(gòu)，該過程稱為復(fù)性。主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級(jí)鍵,經(jīng)過多個(gè)中間折疊最終形成天然三維結(jié)構(gòu)，包涵體很可能就是表達(dá)蛋白不適當(dāng)?shù)闹虚g折疊高濃度積聚在一起的不溶物。由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學(xué)活性，加上劇烈的處理?xiàng)l件，使蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，因此重組蛋白的復(fù)性特別必要。 通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過程開

7、始，到2M 左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時(shí)復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。包涵體蛋白復(fù)性方法   1稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。目前稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續(xù)稀釋三種方式。   2透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成無活性蛋白質(zhì)聚體，且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。   3超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對(duì)透析速度進(jìn)行控制，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可

8、逆的變性。   4柱上復(fù)性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種復(fù)性方法，包涵體蛋白變性后，在色譜柱上復(fù)性，大致可分成疏水柱復(fù)性及凝膠柱復(fù)性兩類。其中的凝膠柱復(fù)性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子篩填料，柱較長（40cm-100cm不等）。相比稀釋和透析兩種方法，色譜柱復(fù)性回收率高（高達(dá)90%以上）、快速、易放大，樣品稀釋倍數(shù)?。ㄒ话阄灞蹲笥遥?    5高蛋白質(zhì)濃度下的復(fù)性：通常有兩種方法，一是緩慢地連續(xù)或不連續(xù)地將變性蛋白加入到復(fù)性緩沖液中，使得蛋白質(zhì)在加入過程中或加入階段之間有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊復(fù)性；二是采用溫度跳

9、躍式復(fù)性，即讓蛋白質(zhì)先在低溫下折疊復(fù)性以減少蛋白質(zhì)聚集的形成，當(dāng)形成聚集體的中間體已經(jīng)減少時(shí)，迅速提高溫度以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊復(fù)性。   此外，吸附法、反膠束法和雙水相萃取法等都可用蛋白質(zhì)的復(fù)性。復(fù)性效果的檢測：    根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測。    1、凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況。    2、光譜學(xué)方法：可以用

10、紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測，但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測。    3、色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同，    4、生物學(xué)活性及比活測定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。    5、黏度和濁度測定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。    6、免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。11防止包涵體的形成： 包涵體很少是100的，有一部分的可溶蛋白存在，一部分是包涵體，通過增加可溶性蛋白的比例為策略，改變折疊中間體的形成速率，降低中間體相互作用，加快正確折疊形成天然結(jié)構(gòu)的速率。1：降低細(xì)胞生長溫度：正在折疊的中間體聚集主要是通過疏水表面相互作用產(chǎn)生，在較低溫度下疏水表面的相互作用減弱，2：共表達(dá)分子伴侶：分子伴侶是一些蛋白質(zhì)，他