RT-PCR技術(shù)在南方蟲媒病毒流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用

1、    RT-PCR技術(shù)在南方蟲媒病毒流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用        摘要目的：調(diào)查南方地區(qū)蟲媒病毒感染情況。方法：應(yīng)用蟲媒病毒的通用引物逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)。結(jié)果：檢測110組騷擾阿蚊、90組白紋伊蚊和18組致倦庫蚊標(biāo)本，分別檢出15組、9組和2組陽性標(biāo)本，陽性率分別為13.63%、10%、11.11%；168份發(fā)燒病人待查標(biāo)本中，28份疑似登革熱血標(biāo)本、11份疑似乙型腦炎血標(biāo)本和3份“不明熱”血標(biāo)本，均擴(kuò)增出413bp的特異帶，證實為蟲媒病毒感染。

2、結(jié)論：我國南方地區(qū)存在除登革病毒和乙型腦炎病毒外的其它黃病毒感染；3種蚊蟲標(biāo)本檢測出的陽性率表明，還可能存在新蟲媒病毒疫源地。關(guān)鍵詞蟲媒病毒； 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) Investigation on the Distribution of Arbovirus in the South of China by ReverseTranscription-Polymerase Chain ReactionsFang MeiyuJiang LianhuaChen Cuihuaet al(Military Medical Institute of Guangzhou Military District,

3、Guangzhou 510507)AbstractAim:To investigate the distribution of arbovirus in the south of China. Methods: Serum samples from 168 patients with unkown fever and the samples mosquitoes were assayed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: The 413bp specific fragment was am

4、plified in 15 of 110 group samples mosquitoes Aedes subalbatus, 9 of 90 group Aedes albopictus and 2 of 18 group Culex quinquefasciatus. The positive rates were 13.63%,10% and 11.11% repectively. Serum sample from 28 patients with suspected dengue fever, from 11 patients with JEV and from 3 patients

5、 with unkown fever was also amplified fragments about 413bp in length. Conclusion: It suggested that there exist more flavivirus infection than DEN and JEV in south China. And from the positive rates of three kinds of mosquitoes samples, we concluded that there perhaps are new arbovirus foci. Key wo

6、rdsArbovirus; RT-PCR蟲媒病毒是指一些通過吸血的節(jié)肢動物叮咬敏感的脊椎動物而傳播疾病的一類病毒。目前我國常見的蟲媒病毒感染為登革熱和乙型腦炎，主要由蚊蟲傳播。我國南方地區(qū)氣候溫暖、潮濕，為蟲媒病毒病的多發(fā)地區(qū)，一些不明原因的發(fā)燒病人，可能與蟲媒病毒感染有關(guān)。為加強(qiáng)對蟲媒病毒的研究及其流行病學(xué)調(diào)查，筆者應(yīng)用本室已建立的RT-PCR技術(shù)，檢測南方不同地區(qū)一批蚊蟲標(biāo)本和發(fā)燒待查病人血標(biāo)本，同時結(jié)合微量細(xì)胞培養(yǎng)病毒，進(jìn)行分離鑒定。1材料和方法1.1標(biāo)本來源19951998年410月，分別從海南省瓊中縣大豐農(nóng)場、萬寧縣興隆農(nóng)場、樂東縣尖峰農(nóng)場、三亞市育才農(nóng)場和廣東省佛山市、番禺沙灣鎮(zhèn)及

7、樂昌市坪石鎮(zhèn)等地采集蚊蟲標(biāo)本共3 560只，其中白紋伊蚊1 230只，騷擾阿蚊1 730只，致倦庫蚊360只，微小按蚊240只。按采集地區(qū)和蚊種不同進(jìn)行分組，20凍死保存。在海南省和廣東省不同地區(qū)采集發(fā)熱待查病人血標(biāo)本168份，于70凍存?zhèn)溆谩Ｒ环矫嬗糜赗T-PCR檢測，另一方面用于病原體微量培養(yǎng)分離。1.2標(biāo)本RNA制備將蚊蟲標(biāo)本用無菌生理鹽水洗3次，每10或20只為一組研磨，然后加入細(xì)胞維持液(內(nèi)含青霉素和鏈霉素)，置4作用4h，5 000r/min離心5min，取上清300l加入等體積含異硫氰酸胍和碘化鈉溶液，混勻后再加入異丙醇，置室溫作用15min，再離心，乙醇洗沉淀物，最后TE緩沖液

8、溶解1，凍存?zhèn)溆谩Ｈ“l(fā)熱原因不明血標(biāo)本300l，加入等體積含異硫氰酸胍和碘化鈉溶液，同樣制備RNA。1.3引物根據(jù)文獻(xiàn)資料，在蟲媒病毒(主要為黃病毒)的NS1基因序列自行設(shè)計了一對通用引物，擴(kuò)增基因序列長度為413bp，在DEN14型和JEV的NS1基因序列分別設(shè)計了5條內(nèi)引物，它們分別與通用引物的下游引物配對形成5對內(nèi)引物，擴(kuò)增的基因序列長度分別為：DNE1型是262bp，DEN2型為189bp，DEN3型是392bp，DEN4型是97bp，JEV是323bp。上述引物基因序列參閱文獻(xiàn)2。1.4病毒DEN14型參考株，由日本Akira Igarashi教授贈送；JEV為日本中山株，本室保存；

9、黃病毒中的黃熱病毒(YF)、Powassan(Pow)和Langat(LGT)，為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈送。各毒株感染C6/36細(xì)胞單層，細(xì)胞病變達(dá)?時收毒。1.5試劑異硫氰酸胍和PCR試劑盒，為華美生物工程公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，為Promega公司產(chǎn)品。1.6RNA逆轉(zhuǎn)錄按文獻(xiàn)2操作。1.7PCR擴(kuò)增及電泳分析首先應(yīng)用通用引物對標(biāo)本進(jìn)行第1次酶促擴(kuò)增，擴(kuò)增出特異條帶后，應(yīng)用內(nèi)引物進(jìn)行第2次擴(kuò)增。兩次PCR循環(huán)均為：93 40s，55 45s，72 60s，分別為30次。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，配制含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，取10l PCR產(chǎn)物電泳，在透射式紫外發(fā)生儀上觀察，并照相記錄實驗結(jié)

10、果。2結(jié)果2.1蚊蟲標(biāo)本應(yīng)用通用引物PCR擴(kuò)增的結(jié)果應(yīng)用通用引物PCR擴(kuò)增白紋伊蚊標(biāo)本90組、騷擾阿蚊110組、致倦庫蚊18組、微小按蚊10組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9組白紋伊蚊標(biāo)本、15組騷擾阿蚊標(biāo)本、2組致倦庫蚊陽性，陽性率分別為10%、13.63%和11.11%。上述陽性標(biāo)本均擴(kuò)增出約413bp的特異條帶(1)，其余標(biāo)本為陰性。1陽性蚊蟲標(biāo)本RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳M.標(biāo)準(zhǔn)分子量；1.海南島尖峰嶺白紋伊蚊；2.海南島大豐農(nóng)場致倦庫蚊；3.海南島鹿母灣林場致倦庫蚊；4.海南島大豐農(nóng)場致倦庫蚊2.2應(yīng)用內(nèi)引物擴(kuò)增蚊蟲標(biāo)本的結(jié)果應(yīng)用黃病毒通用引物擴(kuò)增的陽性蚊蟲標(biāo)本，分別應(yīng)用DEN14型和JEV的內(nèi)引物再

11、進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果26組陽性標(biāo)本均未擴(kuò)增出特異條帶，表明這些蚊蟲的陽性標(biāo)本不是DEN14型和JEV感染所致。2.3發(fā)熱待查的標(biāo)本應(yīng)用通用引物擴(kuò)增的結(jié)果在收集的發(fā)燒待查標(biāo)本中，有53份標(biāo)本疑似登革熱感染，應(yīng)用通用引物PCR擴(kuò)增后28份標(biāo)本為陽性。有20份標(biāo)本疑似乙型腦炎，應(yīng)用通用引物擴(kuò)增陽性11份。余“不明熱”血標(biāo)本95份，擴(kuò)增陽性標(biāo)本3份，均擴(kuò)增出特異條帶約413bp(2)。這3份陽性標(biāo)本均為海南島瓊中縣收集，分別命名為HF4、HF7和HC6。2“不明熱”陽性標(biāo)本RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳1.vero-E6細(xì)胞陰性對照；M.標(biāo)準(zhǔn)分子量； 2.HF7； 3.HC6； 4.HF42.4應(yīng)用內(nèi)引

12、物擴(kuò)增患者血標(biāo)本的結(jié)果通用引物PCR擴(kuò)增登革熱28份陽性標(biāo)本，應(yīng)用DEN14型和JEV的內(nèi)引物擴(kuò)增，結(jié)果表明：DEN1型陽性18份，DEN2型陽性10份，分別擴(kuò)增出262bp和189bp的特異條帶(3)。3登革熱患者PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳M.標(biāo)準(zhǔn)分子量； 15.DEN1型血清標(biāo)本； A.通用引物PCR產(chǎn)物； B.內(nèi)引物PCR產(chǎn)物乙型腦炎陽性的11份標(biāo)本，應(yīng)用JEV的內(nèi)引物擴(kuò)增后，有8份標(biāo)本擴(kuò)增出323bp的特異條帶，3份標(biāo)本未能擴(kuò)增出陽性條帶。“不明熱”的3份陽性標(biāo)本中，應(yīng)用DEN14型和JEV的內(nèi)引物擴(kuò)增，未見陽性特異帶。3討論多種蟲媒病毒都能感染人和動物，該類病毒感染的臨床表現(xiàn)比較復(fù)雜，常

13、常被誤診為其它疾病或冠以“不明熱”。為了解蟲媒病毒在南方地區(qū)的感染情況，我們應(yīng)用自行設(shè)計的蟲媒病毒通用引物(主要為黃病毒)和DEN14型及JEV的內(nèi)引物，檢測了一批南方不同地區(qū)采集的蚊蟲標(biāo)本和一批發(fā)燒待查病人血標(biāo)本。上述通用引物和內(nèi)引物的特異性和敏感性，在我們以前的研究中已證實過3-4。應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增90組白紋伊蚊標(biāo)本，有9組陽性；檢測110組騷擾阿蚊標(biāo)本，有15組陽性；18組致倦庫蚊，有2組陽性。陽性率分別為10%、13.63%、11.11%。進(jìn)一步應(yīng)用DEN14型和JEV的內(nèi)引物擴(kuò)增，未發(fā)現(xiàn)DEN和JEV的特異條帶。應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增53份疑似登革熱血標(biāo)本，28份標(biāo)本為陽性；應(yīng)用內(nèi)

14、引物擴(kuò)增后DEN1型陽性18份，DEN2型陽性10份。疑似乙型腦炎標(biāo)本中，應(yīng)用通用引物擴(kuò)增后陽性11份；“不明熱”標(biāo)本中擴(kuò)增出3份陽性標(biāo)本。上述結(jié)果與我們同時進(jìn)行的病原分離結(jié)果基本一致。其中1株致倦庫蚊陽性標(biāo)本和2株“不明熱”病人血陽性標(biāo)本接種2d齡昆明種乳小白鼠后，可在3d左右發(fā)病，乳鼠表現(xiàn)拒奶、側(cè)臥、抽搐至死亡。這兩份標(biāo)本(均為海南島瓊中縣采集)已克隆到T載體上進(jìn)行測序分析(另文發(fā)表)。上述結(jié)果表明：(1)南方一些地區(qū)的蚊蟲帶有除DEN和JEV以外的黃病毒感染；(2)從“不明熱”血標(biāo)本中檢測到病毒基因，從細(xì)胞培養(yǎng)和乳鼠中也分離到新的蟲媒病毒。提示：我國南方一些地區(qū)存在除DEN和JEV外的其

15、它黃病毒感染；3種蚊蟲標(biāo)本檢出陽性率表明，還可能存在新的蟲媒病毒疫源地。* 全軍“九五”醫(yī)學(xué)科研基金項目作者簡介：女，1945年出生，漢族，1970年畢業(yè)于中山醫(yī)科大學(xué)，研究員，室主任作者單位：方美玉（廣州軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所(郵編 510507)）蔣廉華（廣州軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所(郵編 510507)）陳翠華（廣州軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所(郵編 510507)）白志軍（廣州軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所(郵編 510507)）林立輝（廣州軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所(郵編 510507)）劉建偉（廣州軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所(郵編 510507)）參考文獻(xiàn)1Lopatev VN,Cartas MA, Monken CE,et al. An efficient and simple method of DNA extraction from whole blood and cell lines to identify infectious agents. J virol Methods,1991,34105.2方美玉，陳火勝，陳翠華，等.逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增黃病毒核酸的研究.中華傳染病雜志，1994，12(3)145-148.3方美玉，陳翠華，陳火勝，等.黃病毒