血小板衍生膜微粒對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響

1、血小板衍生膜微粒對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響    作者：陳寶安， 仲悅嬌， 黃成垠， 李翠萍， 史光耀，肖建宇， 唐榮才 丁家華，     高沖，孫耘玉， 程堅(jiān) ， 王駿， 趙剛， 馬燕， 宋慧慧， 費(fèi)菲， 裴孝平    【摘要】 本研究探討血小板衍生膜微粒(platelet?derived membrane microparticles, PMP)對(duì)雞胚絨毛尿囊膜（CAM）新生血管形成的影響。用凝血酶激活血小板釋放出PMP，再經(jīng)高速離心 分離出PMP，用流式細(xì)胞儀檢定P

2、MP，并用BCA法測定PMP的含量。將PMP接種于雞胚絨毛尿囊膜上，觀察PMP對(duì)CAM血管生成的影響。結(jié)果顯示：當(dāng) PMP的濃度為80 g/ml時(shí)，孵育72小時(shí)后混合纖維素濾膜周圍可見到放射狀密集生長的血管網(wǎng), 血管分支數(shù)為112.5±11.31 ，血管面積為（6.19±1.29）?，而在對(duì)照組無特異性密集血管生成，血管分支數(shù)為82.6±8.05，血管面積為1.78±0.33，二組比較有顯著性差異（P0.05）；而與VEGF組比較，后者的血管分支數(shù)為128.4±10.02，血管面積為7.44±1.36，二組比較差異無顯著性。結(jié)論： P

3、MP對(duì)CAM新生血管的生成有促進(jìn)作用。    【關(guān)鍵詞】 血小板膜衍生微粒    Effects of Platelet?derived Membrane Microparticles on Angioge?nesis in Chick Chorioallantoic Membranes    Abstract    This study was purposed to investigate the angiogenesis effe

4、ct of platelet?derived membrane microparticles (PMPs) in chick chorioallantoic membranes (CAM) . Thrombin were adopted to activate the platelets and then PMPs were obtained. PMPs were isolated by high speed centrifugation. Flow cytometry (FCM) was adopted to evaluate the efficiency of thrombin to pr

5、oduce PMPs and BCA method was adopted to evaluate the content of PMPs. PMPs were put into CAM and the effects of PMPs on angiogenesis in CAM were observed. The results indicated that after incubation for 72 hours at the concentration of 80 g/ml PMPs, the vessel nets in a spoked?wheel pattern were sh

6、own around mixed fibrous filter membranes, number of vessel ramification was 112.5±11.31 and ratio of vessel area/CAM area was 6.19±1.29?, but there were not localized allantoic vessels developing in the control group, the number of vessel ramification and ratio of vessel area/CAM area in

7、control group were 82.6±8.05 and 1.78±0.33 respectively, so there was significant difference between PMP and control groups. In above mentioned conditions, the number of vessel ramification and ratio of vessel area/CAM area in VEGF group were 128.4±10.02 and 7.44±1.36 respectivel

8、y, so there was no difference between PMP and VEGF groups. It is concluded that PMPs show promotive effect on the formation of capillaries in chick chorioallantoic membranes.    Key words    platelet?derived membrane microparticle； chick embryo chorioallantoic

9、 membrane; angiogenesis    血小板衍生膜微粒（platelet?derived membrane microparticles, PMP）是血小板在鈣離子載體、凝血酶、高切應(yīng)力、膠原、細(xì)胞因子等誘導(dǎo)劑激活的過程中產(chǎn)生的直徑小于1.0 m的小囊泡顆粒。這種微粒具有促凝活性,可黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞,增強(qiáng)正常血小板的黏附能力1，并含有多種特異性膜糖蛋白和生物活性受體，是血小板活化的標(biāo)志之一。最近的研究證實(shí)，血管生成因子（FGF?2和VEGF）的水平和PMP水平有著很強(qiáng)的相關(guān)性2。PMP能刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移并影響細(xì)胞形態(tài)，以促進(jìn)血管生

10、成的發(fā)生3。本實(shí)驗(yàn)將PMP與雞胚絨毛尿囊膜（CAM）共同孵育觀察PMP對(duì)CAM新生血管的影響。    材料和方法    儀器    血細(xì)胞分離機(jī)為Bexter Fenwel CS?3000。解剖顯微鏡為Olympus?ck2。數(shù)碼相機(jī)：日本佳能公司產(chǎn)品，型號(hào)：I?ZOOM。二氧化碳培養(yǎng)箱為日本Hirasawa公司產(chǎn)品，型號(hào)：WJ?12C。油電兩用恒溫培養(yǎng)箱：上海醫(yī)療器械七廠產(chǎn)品，型號(hào)：PYX?YDH?40×50。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。0

11、.8 m混合纖維素濾膜購自Drummond公司。    血小板懸液由江蘇省血液中心成份科提供，均為血細(xì)胞分離機(jī)采集的健康供血者的新鮮血小板，濃度為（900-1200）×109/L。將血小板懸液于22±2經(jīng)2 500 rpm離心10分鐘，沉淀物懸浮于緩沖液中(Na2EDTA： 9 mmol/L, Na2HPO4：26.4 mmol/L, NaCl:140 mmol/L),并用緩沖液洗滌2次。最后將洗滌的血小板懸浮于Tyrode緩沖液中(NaCl：137 mmol/L, NaCHO3：12 mmol/L, 葡萄糖：5.5 mmol/L,

12、KCl：2 mmol/L，MgCl: 1 mmol/L, NaHPO4：0.3 mmol/L)。調(diào)整血小板濃度為8×108/ml。采用1.0 U/ml的凝血酶激活血小板（放37恒溫?fù)u床上振蕩30分鐘）。激活后的血小板于4， 4 000 rpm離心20分鐘,上清分離于另一試管中，于4， 17 000 rpm， 離心1小時(shí)，并洗滌1次，沉淀物懸浮于Tyrode緩沖液中4，5，整個(gè)操作在無菌條件下進(jìn)行。    血小板衍生膜微粒的定量    等量1多聚甲醛固定PMP后用CD61標(biāo)記PMP，選擇直徑1 m的微粒確定

13、PMP的直徑閾值，同時(shí)設(shè)定同型對(duì)照。用流式細(xì)胞儀分析高速離心前后PMP的純度。采用BCA蛋白濃度定量試劑盒檢測PMP的濃度，步驟如下：根據(jù)樣品數(shù)量，將BCA試劑AB按501的比例配成BCA工作液，充分混勻。用緩沖液II溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度為0.5 mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、16、20 l分別加入96孔板中，加緩沖液II補(bǔ)足到20 l。加20 l PMP到96孔板各孔中，各孔中加入200 l BCA工作液，37放置30分鐘。用酶標(biāo)儀測定570 nm處各孔吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷PMP的蛋白濃度。    種蛋的消毒和孵育

14、0;   純種華聯(lián)司法部購自南京制藥機(jī)械廠。利用光照選擇鈍端氣室小的雞卵（產(chǎn)蛋時(shí)間為7天），要求表面清潔，蛋殼均質(zhì)，每個(gè)50-65 g，蛋形規(guī)范。種蛋用溫水清洗、擦干，于40-45的新潔爾滅液（11 000稀釋）中浸泡3分鐘，擦干放入蛋托，用紫外線消毒30分鐘備用。將隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱通電預(yù)熱，使溫度升至37.0。種蛋孵育于隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，溫度37.0±0.5，培養(yǎng)箱中同時(shí)放入一小燒杯水，保持濕度在40%-60%。種蛋氣室向上，蛋托與胚蛋長軸約呈70-80°，每天早晚各小心轉(zhuǎn)動(dòng)1次。    PMP

15、對(duì)CAM新生血管的影響    取孔徑為0.8 m的混合纖維素濾膜,用打孔器制成直徑5 mm的小圓片,放蒸餾水浸泡后，滅菌備用。取孵化的9日齡胚蛋，隨機(jī)分為4組，每組20只蛋。在照卵燈下尋找胚頭右下方血管稀少區(qū)，劃定1 cm×1 cm圓形開窗位置，在雞胚氣室端鉆1 mm小孔并穿透殼膜。用75% 乙醇消毒開窗部位，用手術(shù)剪輕輕揭去蛋殼及殼膜，暴露出雞胚絨毛尿囊膜，將混合纖維素濾膜放置于尿囊膜上血管較少的部位。實(shí)驗(yàn)分組： 對(duì)照組（生理鹽水）； 40 g/ml PMP組； 80 g/ml PMP組； 10 l/ml VEGF組。用微量進(jìn)樣器分別將上述液

16、體20 l滴入濾膜中，然后用無菌透明膠帶封窗，放入孵化箱，繼續(xù)孵化。3天后揭去透明膠帶，加入適量甲醇、丙酮等量混合固定液，在室溫下固定15分鐘。然后以混合纖維素濾膜為中心，剪取3 cm的CAM，放入盛有水的平皿中展開，然后平鋪于濾紙上，制成CAM標(biāo)本。    結(jié)果判斷    在解剖顯微鏡下觀察雞胚絨毛尿囊膜血管的生長情況,數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行原位攝影。用掃描儀掃描底片,選取畫面清晰者, 選用Imagetool 軟件處理圖像統(tǒng)計(jì)出混合纖維素濾膜周圍5 mm范圍內(nèi)的血管分支點(diǎn)數(shù)6，并計(jì)算出所選區(qū)域血管面積與CAM面積的比值。&

17、#160;   統(tǒng)計(jì)分析    利用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用秩和檢驗(yàn)。    結(jié)    果    制備的PMP的純度鑒定    流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，1.0 U/ml凝血酶作用后的PMP釋放率為50.1%； 17 000 rpm離心1小時(shí)后PMP的純度99（圖1）。    實(shí)驗(yàn)開始時(shí),每組雞胚數(shù)為20個(gè),到第11

18、天取膜時(shí)各組存活的雞胚均在15枚以上。對(duì)照組CAM血管形態(tài)呈自然生長狀態(tài)下的葉脈狀(圖2A) , 40 g/ml PMP組與對(duì)照組無差別，80 g/ml PMP組及VEGF組在混合纖維素濾膜周圍可見到不同程度放射狀密集生長的血管網(wǎng)(圖2B、2C) ,而對(duì)照組及低    Figure 2. Allantoic vessels in three groups after incubation for 72 hours. A: normal growth of blood vessels in chick chorioallantoic membrame; B

19、: blood vessel net in a spoked wheel pattern; C: vasoproliferative response comparable to that induced by VEGF (Original magnification:×6.1)    濃度PMPs組均無特異性密集血管生成。各組CAM血管分支點(diǎn)數(shù)及血管面積的比較見表1。當(dāng)PMP的濃度為80 g/ml時(shí)，CAM的血管生成表現(xiàn)形式、血管分支點(diǎn)數(shù)和血管面積均優(yōu)于對(duì)照組,與對(duì)照組比較差異有顯著性(P0.05)。結(jié)果表明，PMP（80 g/ml）對(duì)CAM

20、新生血管的生成有明顯促進(jìn)作用。    討    論    PMP是血小板在誘導(dǎo)劑作用下，細(xì)胞膜以出芽方式形成囊泡或偽足斷裂而形成直徑    血管新生是指從已經(jīng)存在的毛細(xì)血管或微靜脈通過內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移, 最后以芽生或非芽生的方式擴(kuò)展出更多的血管網(wǎng)。由于雞胚處于對(duì)各種外來抗原免疫耐受階段,對(duì)所加測試藥物不會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng),而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果可在解剖顯微鏡下或肉眼下直接觀察,并可將圖像輸入計(jì)算機(jī),進(jìn)一步觀察新生血管情況,量化觀察指標(biāo)，雞胚尿囊膜技

21、術(shù)已成為國內(nèi)外研究血管生長常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。與其它動(dòng)物模型相比,雞胚生命力較弱,對(duì)環(huán)境變化敏感,抗感染力差。而且,發(fā)育時(shí)間越短越是如此。在雞胚發(fā)育前10天中有一個(gè)死亡高峰,出現(xiàn)在雞胚發(fā)育的3-5天。而5天后雞胚發(fā)育進(jìn)一步完善,7天時(shí)雞胚已可自己產(chǎn)生體溫,對(duì)外界環(huán)境變化適應(yīng)力增強(qiáng),死亡率大大降低。直到第8天時(shí)散在分布于中胚層的不成熟血管才形成毛細(xì)血管叢,覆蓋在絨毛上皮細(xì)胞表面。毛細(xì)血管快速增殖持續(xù)到第11天，此后內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂指數(shù)迅速下降13, 到第18天, 血管系統(tǒng)最終形成。雞胚孵化至第8天 時(shí), 胚膜和血管網(wǎng)的發(fā)育已趨穩(wěn)定, 而機(jī)體免疫系統(tǒng)尚未完全建立, 此時(shí)對(duì)各種異物幾乎不產(chǎn)生排斥反應(yīng),

22、便于觀察各種誘導(dǎo)劑和抑制劑對(duì)血管生成的影響。本實(shí)驗(yàn)選擇雞胚發(fā)育的第9 天為給藥期，位于CAM 血管發(fā)育的中期，是CAM 血管生長的高峰時(shí)間，可以明確地觀察到PMP促血管生成的作用。經(jīng)過72小時(shí)的孵育，結(jié)果顯示PMP(80 g/ml)組及VEGF組在混合纖維素濾膜周圍均可見到不同程度放射狀密集生長的血管網(wǎng)，而對(duì)照組與低濃度PMP組無特異性密集血管生成。PMP(80 g/ml)組及VEGF組在血管生成的表現(xiàn)形式、血管面積和血管分支點(diǎn)數(shù)計(jì)數(shù)方面均優(yōu)于對(duì)照組及低濃度PMP組，差異有顯著性(P    0.05)。因此可以得出結(jié)論，PMP在體內(nèi)能有效的促進(jìn)血管的生成

23、，但確切的作用途徑有待進(jìn)一步研究。    【參考文獻(xiàn)】 1Owens MR, Holme S, Cardinali S. Platelet microvesicles adhere tosubendothelium and promote adhension of platelets. Thromb Res,1992; 66 :247-2582Pintucci G., Froum S, Pinnell J, et al. Trophic effects of platelets on cultured endothelial cells are medi

24、ated by platelet?associated fibroblast growth factor?2 (FGF?2) and vascular endothelial growth factor (VEGF).Thromb Haemost, 2002;88: 834-8423Kim HK, Song KS, Chung JH, et al. Platelet microparticles induce angiogenesis in vitro. Br J Haematol, 2004; 124:376-3844Voermans C,van?Hennik PB, van?der Cho

25、ot CE. Homing of human hematopoietic stem and progenitor cells: new insights, new challenges? J Hemtother Stem Cell Res,2001;10:725-7285Wantanabe T, Dave B, Heimann DG, et al. Cell adhesion molecule expression on CD34 cells in grafts and time to myeloid and platelet recovery after autologous stem ce

26、ll transplantation. Exp Hematol, 1998;26:10-186劉靜霞,龍超良,楊永林等. 1H2異吲哚21 ,3(2H)?二酮新衍生物對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管新生的抑制作用研究. 中國藥理學(xué)通報(bào),2004;20:1375-13787Sims,PJ, Wiedmer T, Esmon CT, et al. Assembly of the platelet prothrombinase complex is linked to vesiculation of the platelet plasma membrane. Studies in Scott syndrome: an isolated defect in platelet procoagulant activity. J Biol