Western Blotting分子實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、Western Blotting朱羽桐（生物學(xué)基地班）摘要： Western Blotting是將經(jīng)電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移并固定在化學(xué)合成膜（常用的是硝酸纖維素膜和尼龍膜）的支持物上，然后以特定的親和反應(yīng)、免疫反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)以及顯色系統(tǒng)分析此印跡。此法用于檢測(cè)材料中某種蛋白質(zhì)的相對(duì)含量。本實(shí)驗(yàn)采用人血清為材料，對(duì)此樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素薄膜上，以兔抗人IgG為第一抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體，加入過氧化物酶的底物，檢測(cè)人的IgG。 關(guān)鍵詞： Western Blotting SDS-PAGE 電轉(zhuǎn)移法 N

2、C膜 人血清IgG 一抗 二抗引言： 本次試驗(yàn)的目的是使同學(xué)們掌握Western Blotting法鑒定目標(biāo)蛋白的原理和熟悉Western Blotting的方法，并了解抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的影響因素。 Western Blotting的 blotting譯為印跡法，是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的

3、蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。 Western既可以定性，又可以半定量，是初步鑒定蛋白質(zhì)最方便也是最通用的方法。它通常分為兩種方法：Western Blotting方法一: 直接法方法二: 間接法優(yōu)點(diǎn)：1.快速（一種抗體）2.沒有二抗交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶1. 免特異性不受標(biāo)記影響2. 信號(hào)放大靈敏度高（多個(gè)二抗結(jié)合位點(diǎn)）3. 多種標(biāo)記的二抗可供選擇4. 可選擇不同的Marker缺點(diǎn)：1.免疫反應(yīng)性降低2.無信號(hào)二級(jí)放大3.抗體標(biāo)記費(fèi)時(shí)昂貴,使用不方便1. 交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶2. 額外的二抗孵育以及條件優(yōu)化同

4、時(shí)Western又具有多種識(shí)別蛋白質(zhì)的顯色方法，主要有以下幾種：i. 放射自顯影 ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECL iii. 底物熒光ECF iv. 底物DAB呈色 現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色。一、實(shí)驗(yàn)原理Western Blotting（蛋白質(zhì)免疫印跡法）是將經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳奮力的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)為抗原，與之對(duì)應(yīng)的第一抗體發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，一抗再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色活放射自顯影以檢查電泳分離的提議目的蛋白成

5、分。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測(cè)定特異性高、敏感等諸多優(yōu)點(diǎn)，能從復(fù)雜混合物中對(duì)特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測(cè)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)和催化劑(AP)、加速劑(TEMED聚合成的三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)(凝膠）。據(jù)有無濃縮效應(yīng)可將電泳分為兩類：i. 連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液pH值、凝膠濃度相同，帶電粒子靠電荷及分子篩效應(yīng)區(qū)分。ii. 不連續(xù)系統(tǒng)：緩沖離子成分、 pH值、凝膠濃度不同，帶電粒子在電場中由電效應(yīng)、 分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)區(qū)分。SDS-PAGE的原理是：依靠SDS帶有大量負(fù)電荷來掩蓋蛋白質(zhì)表面的凈電荷：同時(shí)由于在電泳溶液中加入了SDS和巰基

6、乙醇，因此它還可以改變蛋白質(zhì)構(gòu)象：在實(shí)驗(yàn)中要注意：印跡法需要較好的蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)，是蛋白質(zhì)樣品達(dá)到良好的分離效果，而且要注意膠的質(zhì)量，是蛋白質(zhì)容易轉(zhuǎn)移帶固相支持物上，另外蛋白質(zhì)在電泳過程中分離得到的條帶被保留在膜上，在隨后的寶物階段不丟失和擴(kuò)散。免疫印跡分析之需要很小體積的時(shí)間，較短的時(shí)間過長，操作容易，適用于理論和應(yīng)用上的研究。本實(shí)驗(yàn)采用人血清為材料，人類Ig根據(jù)其重鏈穩(wěn)定區(qū)的分子結(jié)構(gòu)和抗原特異性的不同，分為五類：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中 IgG占血清免疫球蛋白總量的75%80%。人的IgG由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，它們之間以二硫鍵相連。在加SDS的電泳條件下，分子中

7、的二硫鍵被還原成游離的巰基，四條鏈分開，重鏈遷移速度較慢，輕鏈遷移速度較快，可跑出兩條帶。對(duì)此樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素薄膜上，用兔抗人IgG為第一抗體，用辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體，在過氧化物酶第五存在的情況下，檢測(cè)人的IgG。二、試劑，器材和實(shí)驗(yàn)材料【試劑】1. 30丙烯酰胺貯備液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉雙丙烯酰胺，加重蒸水至100ml。2. 濃縮膠緩沖液：0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8。3. 分離膠緩沖液：3mol/L Tris-HCl，pH8.9。4. 10過硫酸銨(w/v)：臨

8、用前用蒸餾水配制。5. 10SDS(w/v)。6. 10TEMED。7. 電極緩沖液：甘氨酸 11.28g, SDS 0.4g, Tris 2.4g, 加水至800ml，pH8.3。8. 樣品緩沖液：0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，pH6.8，20甘油，4SDS，10巰基乙醇，0.005溴酚蘭。9. 考馬斯亮藍(lán)R250染色液：考馬斯亮藍(lán)R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸。10. 脫色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。11. TBS（Tris-HCl,NaCl）緩沖液：20mmol/L Tris-HCl,12. 500mmol/L NaCl，pH7.5，每組配1

9、50ml。13. TTBS：取100mlTBS，加250l 20Tween-20。14. 封閉液及抗體稀釋液：3脫脂奶粉-TBS，每組配10ml。15. 底物溶液：2.5mg二氨基聯(lián)苯胺（DAB）+ 10mlTBS +10l H2O2，臨用前配制。16. 考馬斯亮藍(lán)R250染色液：考馬斯亮藍(lán)R250 0.25g，30%乙醇，10%冰乙酸，總體積500ml。17. 脫色液：乙醇6ml，冰乙酸2ml，加水至20ml。【器材】1. 夾心式電泳槽2. 轉(zhuǎn)移電泳槽3. 電泳儀【實(shí)驗(yàn)材料】1. 人血清2. 硝酸纖維素膜3、 實(shí)驗(yàn)步驟 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1. 灌膠前的準(zhǔn)備： 將兩塊玻璃板洗凈晾干或用吹

10、風(fēng)機(jī)吹干，嵌入本體的凹槽中，長玻板朝外，短玻板朝內(nèi)，兩塊玻璃板之間就形成了凝膠室。合上滑塊，擰螺栓鎖緊凝膠室，檢查凝膠室底部是否與本體底端重合。然后將以上組合放入制膠架，插入并旋轉(zhuǎn)凸輪，即可灌膠。2. 配制膠液膠液濃度% 分離膠 濃縮膠 12%4%30%貯備液(ml) 3.20.53分離膠緩沖液(ml) 2濃縮膠緩沖液(ml) 1.0重蒸水(ml) 2.662.3610%SDS(ul) 8040混勻后再加入以下試劑： 10%TEMED(ul) 804010過硫酸銨(ul) 4020總體積(ml) 843. 灌 膠：將配制好的分離膠液倒入兩塊玻璃板之間的凝膠室中，待膠液加至距短玻璃板 頂端約1.

11、5cm處時(shí)停止灌膠，然后在膠液表面上小心加入厚約0.5cm的水層，以保持分離膠面平整，同時(shí)隔絕空氣，空氣中的氧對(duì)凝膠的聚合有阻礙作用。待凝膠和水之間出現(xiàn)清晰界面時(shí)，說明分離膠已聚合 ，大約30min完成聚合。傾去分離膠上層的水，將配制好的濃縮膠液加到分離膠上，至接近短玻璃板的頂端 ，插上樣品梳，放置待其聚合。4. 配制電極緩沖液：甘氨酸 14.1g，SDS 0.5g，Tris 3g，加水至1000ml，pH8.3。每組配1000ml。5. 制 樣：5l人血清，加45l水，再加50l加樣緩沖液。沸水浴加熱8分鐘，10000rpm離心2分鐘,取上清液作為樣品。另按說明書制備好蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)樣品。

12、 6. 加 樣：1、加入電極緩沖液；a) 拔出樣品梳；b）選3個(gè)樣品槽，用微量進(jìn)樣器加樣，中間槽加入5l分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品，兩旁槽各加入10l人血清樣品。 穩(wěn)壓120V電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿到達(dá)距底部0.5cm左右時(shí)，停止電泳。7. 切 膠：根據(jù)切割線，先豎切后橫切，寬膠條為兩泳道，含人血清樣和分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣，考馬斯亮藍(lán)R-250全蛋白染色。窄膠條為一泳道，為人血清樣，轉(zhuǎn)印后對(duì)目標(biāo)蛋白免疫染色。8. 膠條保存：將兩個(gè)膠條用保鮮袋包好，貼上標(biāo)有自己名字的標(biāo)簽-20 凍存。 轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)到硝酸纖維素膜上1. 將帶有人血清和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的寬膠帶用考馬斯亮藍(lán)R250染色、脫色：將寬膠條放到培養(yǎng)皿中，用蒸餾水清

13、洗后，加入約10ml考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色1小時(shí)左右，然后換成脫色液脫色，不時(shí)搖動(dòng)。更換幾次脫色液，至背景無色透明，條帶清晰為止。2. 放置NC膜和膠條：a) .切割與膠尺寸相符的硝酸纖維素膜，用轉(zhuǎn)移緩沖液或水浸泡5min使之濕潤。b) .準(zhǔn)備2張濾紙和海綿一起浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。c) 打開轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移槽的膠板，依次放入：a.一張浸濕的海綿 b. 一張浸濕的濾紙c. 用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗過的膠，并小心地趕走濾紙和膠之間的氣泡d. 硝酸纖維素膜，在膜的右下角剪一小角，以標(biāo)明電泳方向e. 一張浸濕的濾紙f. 一張浸濕的海綿。3. 轉(zhuǎn) 移：小心地合上膠板，按膠側(cè)為負(fù)極，膜側(cè)為正極的方向放入轉(zhuǎn)移電泳槽

14、中，加轉(zhuǎn)移緩沖液至滿。插好轉(zhuǎn)移電泳裝置的電極，打開電泳儀開關(guān)調(diào)至穩(wěn)壓60V，電泳1h，轉(zhuǎn)移結(jié)束后打開膠板取出硝酸纖維素薄膜。 膜的酶聯(lián)免疫染色1. 封閉：用TBS緩沖液洗膜1min后，將膜封入塑料薄膜袋內(nèi)，留一開口。加封閉液1ml后封閉開口，37搖床上搖動(dòng)30min。2. 加封閉液及抗體 a)與第一抗體結(jié)合(1) 棄封閉液，加入適當(dāng)稀釋的1ml第一抗體溶液(兔抗人IgG)，封口后37搖床上輕輕搖動(dòng)50min。(2) 取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。再封入一新的塑料薄膜袋內(nèi)。 b)與酶標(biāo)第二抗體結(jié)合(3) 加入適當(dāng)稀釋的1ml辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，37搖床上輕輕搖動(dòng)50min

15、。(4) 取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。 加底物溶液顯色將膜浸入10ml底物溶液中，至顯色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。轉(zhuǎn)入水中保存。3. 結(jié)果分析：在凝膠成像分析系統(tǒng)上照相，并分析結(jié)果。測(cè)量分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移距離，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測(cè)出硝酸纖維素膜上的人IgG帶的遷移距離，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出人IgG重鏈的分子量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 做標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的的凝膠的總長為7.53cm條帶1條帶2條帶3條帶4條帶5條帶6蛋白條帶標(biāo)準(zhǔn)分子量Mr/KDa66.245.035.025.018.414.4logMr1.821.651.541.401.261.

16、16蛋白質(zhì)條帶遷移距離/cm1.582.413.174.185.155.82相對(duì)遷移率0.210.320.420.560680.77帶有人血清IgG的硝酸纖維素膜的總長為7.24cmIgG輕鏈遷移距離/cmIgG輕鏈相對(duì)遷移率IgG重鏈遷移距離/IgG重鏈相對(duì)遷移率數(shù)值4.080.562.380.33由公式y(tǒng) = -1.1451x + 2.0366知： 當(dāng)x（重鏈相對(duì)遷移率）=0.33時(shí)，y=1.6587 得IgG重鏈相當(dāng)分子量為：45.57KDa 當(dāng)x（輕鏈相對(duì)遷移率）=0.56時(shí)，y=1.3953 得IgG輕鏈相當(dāng)分子量為：24.85KDa討論：1、 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1. .丙烯酰胺和甲叉雙

17、丙烯酰胺有神經(jīng)毒性，注意不要沾在皮膚上，如有沾染可用水洗凈。聚合成聚丙烯酰胺后毒性即消失。2. 電泳槽只能用水沖洗，不能用刷子刷，以免刷斷鉑電極絲；注意保護(hù)玻璃板。3. 一抗的選擇是影響免疫印跡成敗的主要因素。多克隆抗體結(jié)合抗原能力較強(qiáng)、靈敏度高，但易產(chǎn)生非特異性的背景；單克隆抗體識(shí)別抗原特異性較好，但可能不識(shí)別在樣品制備時(shí)因變性而失去了空間構(gòu)型的抗原表位，且易發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，兼有多克隆抗體和單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)的混合單克隆抗體近年特別被推薦，它是由一組能與抗原分子中的不同且不易變性的抗原表位結(jié)合并不易出現(xiàn)交叉反應(yīng)的單克隆抗體混合構(gòu)成。4. .如果反應(yīng)靈敏度不高，可增加凝膠的厚度到1.5mm（厚

18、度超過2.0mm時(shí)，凝膠轉(zhuǎn)移效率受限）；也可在電泳條帶不發(fā)生變形的前提下，盡量提高蛋白樣品的上樣量。5. 濾紙/凝膠/轉(zhuǎn)印膜/濾紙夾層組合中不能存在氣泡，可用玻璃棒在夾層組合上滾動(dòng)將氣泡趕出，以提高轉(zhuǎn)膜效率；上下兩層濾紙不能過大，避免導(dǎo)致直接接觸而引起短路。6. 如果出現(xiàn)非特異性的高背景，可觀察僅用二抗單獨(dú)處理轉(zhuǎn)印膜所產(chǎn)生的背景強(qiáng)度，若高背景確由二抗產(chǎn)生，可適當(dāng)降低二抗?jié)舛然蚩s短二抗孵育時(shí)間；并考慮延長每一步的清洗時(shí)間。7. 一抗與二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)檢測(cè)不同的蛋白要求不同，須經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。8. 一般情況使用0.45m的NC膜，0.10.2m的小孔徑膜只適合于分子量小于20kD的蛋白質(zhì)。2、 實(shí)驗(yàn)思考題：1. 12%的分離膠適合分離多少分子量范圍的蛋白質(zhì)？答：由分子克隆中的分離膠濃度與蛋白質(zhì)分子量線性關(guān)系圖知，12%的分離膠適合分離分子量范圍在15-60KDa的蛋白質(zhì)。2. 電極緩沖液中甘氨酸的作用?答：SDS-PAGE中樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸，電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動(dòng)，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大，