酶解法對琉璃苣油脂的改良

1、酶解法對琉璃苣油脂的改良通過混合辛酸和二十碳五烯酸對油脂結(jié)構(gòu)的酸化水解摘要：使用兩種固定的酶，從球狀菌提取的非特異性酶SP435和從米赫根毛霉中提取的sn-1,3特異性脂肪酶IM60作為生物催化劑對琉璃苣油脂結(jié)構(gòu)進行重組。利用混合脂肪酸(中鏈脂肪酸10：0)和二十碳五烯酸(20：5n-3)作為游離脂肪酸的?；w.在己烷中完成的脂交換反應(yīng)，用氣液相色譜進行分析。改性琉璃苣油的脂肪酸組成和不改性琉璃苣油的脂肪酸組成是不同的。用IM60脂肪酶水解得到20:5n-3(10.2%)和10:0(26.3%)高度化合物,但用SP435脂肪酶水解，只有8.8的20:5n-3與15.5%10:0化合。盡管如此

2、，SP435脂肪酶能夠在sn-2位置上10:0和20:5n-3化合，但IM60脂肪酶不能。在logP值進行酸解反應(yīng)比在。關(guān)鍵詞：琉璃苣油、念株菌屬antarctica、脂肪酶、中碳鏈脂肪酸、n-3多不飽和脂肪酸、根毛酶屬miehei、甘三酯。琉璃苣油脂是一種工業(yè)上制取必須脂肪酸-亞麻酸和谷氨酸的重要原料。近年來，通過研究發(fā)現(xiàn)所生產(chǎn)的谷氨酸可以用于皮膚病和其他一些疾病的治療。對于人類和其他哺乳動物來說，谷氨酸是亞麻酸被-6去飽和酶酶解成前列腺素時的第一個代謝產(chǎn)物。過量的不飽和脂肪酸具有引導(dǎo)生物合成前列腺的機能.白細(xì)胞三烯類的2位和4位連在一起，在一定的環(huán)境下何以增強血管壁的收縮，血小板的凝聚力，

3、以及免疫力的提高和monokiness 降低。例如：20:5n-3不飽和脂肪酸對二位串聯(lián)花生類脂肪酸的影響，通過對組織內(nèi)花生四烯酸的代謝產(chǎn)物在去飽和酶及環(huán)氧化合酶合成脂肪酸組織過程中競爭來抑制脂肪酸的裂解。而三位的不飽和脂肪酸被考慮用于消炎，以往的研究證明。N3不飽和脂肪酸能降低心血管病的發(fā)病率三酰基甘油的類脂構(gòu)造包括短鏈、中鏈、長鏈脂肪酸。在人們想得到的脂肪酸中，甘油分子被為是最有效釋放胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤的短鏈分子，從而得到營養(yǎng)品。因此作為功能性脂類，醫(yī)學(xué)或醫(yī)藥用脂類，用于調(diào)理患的特非疾病病人的代謝狀況，也可作為最好的營養(yǎng)品。但脂肪酸組織可能對免疫反應(yīng)有影響，例如。綜合花生四烯酸會導(dǎo)致

4、發(fā)炎。中鏈脂肪酸能更快的從血液中吸收，因為他的分子較小，且溶解性較大，在腸道內(nèi)被快速的吸收氧化分解并轉(zhuǎn)化為能量。對代謝紊亂的病人來說身體就能能獲得高的能量。因為中鏈脂肪酸很少被轉(zhuǎn)化為脂肪儲藏在組織中，更多的則是被氧化成為能量。脂肪在酶解反應(yīng)過程中，能夠進行脂肪酸的重組。例如植物油的多不飽和脂肪酸酯基轉(zhuǎn)移作用已經(jīng)被成功的用于脂類的重組。在目前的研究當(dāng)中，正試圖用此方法來調(diào)整琉璃苣油脂當(dāng)中的不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為18:3n-6,20:5n-3這兩種固脂。我們在此將研究影響這以反應(yīng)的因素，如摩爾比、反應(yīng)時間、酶負(fù)荷、水及溶劑類型等。原料和方法：原料：琉璃苣油 ; 豬胰脂肪酶; 葵酸（10：0，純度99）

5、從海綿中用化學(xué)方法提?。–o. ST .Louis. Mo）; 固脂 Sn-1；特異性酶IM60; 非特異性酶SP435。這個反應(yīng)在北美洲，提供了新的生物條件。 包括：二十碳五烯酸 20:5n-3魚油不飽和脂肪酸（純度45%）蘇格蘭和英國覽核王國的一些新興公司提供。溶劑被分析后確定使用，完成。 除非特異性酶的存在，酶對琉璃苣油脂的重組反應(yīng)是整體性的。酶解反應(yīng)混合溶液包括：琉璃苣油（100mg）； 20：5n-3 (76mg)10:0(40mg) , 摩爾比分別1：2：2 和 10 的酶底物（w/w）和5的水。3ml的己烷 將該混合懸浮液放置在定軌振蕩器上振蕩。溫度控制在55，每分鐘200轉(zhuǎn)，時

6、間為24個小時。然后放入4 分子篩。反應(yīng)2個小時以后，所有成分達到平衡。用玄明粉把產(chǎn)物中的酶過濾除去后，分析產(chǎn)物。將改良后的琉璃苣油脂中的胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤，通過薄層層析單獨分離出來。再放入槽寬60的石英皿中，用石油醚/乙醚/乙酸(體積比為90：10：1)的混合溶劑作為顯影溶劑。帶狀的中性粒分子在低于紫外線光譜輻射下被顯影，再用含二氯熒光素0.2的甲醇噴霧，利用這種方法，將帶狀粒分子（胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤）從薄層色譜板上擦除。放入3毫升含6的HCL的甲醇溶液進行甲基化，溫度在7080攝氏度，反應(yīng)時間為2個小時。反應(yīng)生成的甲基脂肪酸酯通過二次萃取取出，并加入2ml己烷和過量的硫酸鈉，通

7、入氮氣進行濃縮。使用HP8590型氣液相色譜議，其中毛細(xì)管柱為PB-255熔硅毛細(xì)管柱，長度30m，直徑0.25mm（惠普公司提供）和FID檢測器，對濃縮脂肪酸組分進行分析。兩次采樣溫度分別為250和260攝氏度，操作時溫度控制在190攝氏度，時間為5分鐘，然后以每分鐘20攝氏度的速度上升到215攝氏度，再通入氮氣，氣體流速為23ml/min。甲基脂肪酸的相對摩爾百分比被定量并通過聯(lián)機的計算機將其與十七酸（17：0）的標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線進行比較鑒定。 脂肪酸的特異性結(jié)構(gòu)Sn-2對脂肪酸重組改良反應(yīng)的影響。在琉璃苣油脂中的胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤的脂肪酸特異性結(jié)構(gòu)Sn-2的分布決定了重組改良反應(yīng)的順序

8、。琉璃苣油脂中的胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤從薄層層析中被隔離開，再用豬胰臟脂肪酶催化合成2單?；视?。通過己烷/乙醚/乙酸（體積比為50/50/1）進行甲基化，最后用甘油從薄層層析皿中層析分離出來得到甲基脂肪酸酯。 結(jié)果討論：對琉璃苣油脂的轉(zhuǎn)酯基作用反應(yīng)是通過Sn-1，3-特異性酶IM60和非特異性脂肪酶SP435對混合溶劑在己烷中進行催化，然后使混合液中的琉璃苣脂肪酸?；旌先軇榱鹆к挠?，20：5n-3和10：0，摩爾比為1/2/2,反應(yīng)時間為24小時。這個混合物中琉璃苣油的脂肪酸組成在不同摩爾比的反應(yīng)底物條件下生成的產(chǎn)物不同，如表1所示結(jié)果顯示混合物中 20：5n-3的分別在10的IM60和

9、8.8的SP435 含量大致相同，但是在 IM60含量為26.3的情況下10:0的含量要比SP435為15.5時要高。SP435在催化葵花籽油時產(chǎn)生較多的20：5n-3脂肪酸，因此被稱為Sn-1，3特異性酯化酶，而IM60使部分純度為45的不飽和游離脂肪酸成為20：5n-3的?；w。在IM60和SP435轉(zhuǎn)酯基作用后琉璃苣油中總體的多不飽和脂肪酸含量分別減少了21.5和14.7，同時，飽和脂肪酸的含量增加。通過Foglia和Sonnet指示器，我們了解了這一催化反應(yīng)的過程。例如，SP435在?；D(zhuǎn)移的作用下使原來位置上的?；蛛x，而將其余的基團保留下來。與此同時，n-6多不飽和脂肪酸被還原，

10、生成飽和脂肪酸，并進行重組得到20：5n-3和10:0的中鏈脂肪酸?？刂泼复俜磻?yīng)的時間必須是嚴(yán)格的，要求用盡量少的時間得到最多的產(chǎn)物并盡可能的降低生產(chǎn)成本。酯基轉(zhuǎn)移作用的轉(zhuǎn)化率如表2所示： 該圖表展示出隨著反應(yīng)時間的增加，20：5n-3和10:0混合溶液中的胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤的含量增加。大概在反應(yīng)初期的1016個小時，生成的魚油不飽和脂肪酸和癸酸的含量迅速提高。大約40小時左右以后混合物中的組分達到最佳。 隨著酶促反應(yīng)底物的摩爾比（胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤：?；w、20：5n-3和10:0）的提高而使得酶的負(fù)荷反應(yīng)能力有所增強。例如，酶IM60的最大負(fù)荷能力出現(xiàn)在10:0的含量為5.3

11、，而摩爾比在1：2：2和1：3：3之間的條件下，且20：5n-3的含量為5.5，摩爾比為1：1：1和1：2：2之間。我們曾嘗試過在另外一些溶劑中進行反應(yīng)實驗，例如，異辛烷，戊烷，己烷，甲苯，丙酮和乙腈，最終確定了轉(zhuǎn)化率較高的混合溶劑有20：5n-3和10:0以及己烷和異辛烷，如表2所示：這兩種混合溶劑具有很高的P值，它的分配常數(shù)在水和辛醇之間。它們與P值相對較低的溶劑如戊烷和甲苯顯示出更好的生物活性，而象丙酮和乙腈的P值則非常低。通過測定將20：5n-3和10:0這兩種溶劑混合，會降低它們的P值，同時增強生物活性。經(jīng)研究指出，一定量的水對于維持酶的三羧酸循環(huán)是必須的，不管怎樣，通常過量的水會導(dǎo)

12、致酯化物水解。當(dāng)SP435作為催化劑對植物油脂進行催化時，過量的水會減少其中20：5n-3的含量。如表3所示：通過表3可得出這樣一個結(jié)論：20：5n-3和10:0在加入水以后SP435的活性降低，而在加入IM60時SP435的活性被加強。這說明IM60在酸性條件下進行脂肪酶解時比SP435具有更強的耐水性質(zhì)。通常Sn-1，3-特異性脂肪酶按照其催化性質(zhì)，對混合物中胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤中的Sn-1和Sn-3位置單一進行催化后產(chǎn)生?；荒芟髣e的化學(xué)催化劑那樣進行酯基轉(zhuǎn)移作用，從而無法獲得常規(guī)性產(chǎn)物。這種專門針對胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤的Sn-1，3-特異性脂肪酶在大自然中非常少見，所以，我

13、們僅僅能夠使用普通的脂肪分解酶來配制獲得這種特性的脂肪酶。例如：利用IM60對胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤的Sn-1和Sn-3位置和18:3n-6在Sn-2位上進行催化。而利用SP435對20：5n-3和10：0在Sn-2位置上進行催化。這時在自然界很難獲得的特異性脂肪酸被輕易的得到。通過對中鏈脂肪酸和n-3多不飽和脂肪酸的催化 如表4所示：胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤可以應(yīng)用于飲食治療疾病。因為，在大多數(shù)哺乳動物體內(nèi)的脂肪酸，例如：通過胰脂肪酶的催化20：5n-3和10：0在Sn-1，3位置上被迅速分解釋放能量，且 20：5n-3是除了18：2n-6最有可能獲得必須脂肪酸的脂類。在通過IM60對琉璃苣油脂的改良時充當(dāng)特異性脂肪酶對Sn-1,3，我們測定發(fā)現(xiàn)20:5n-3和10：0在Sn-2位置上被催化。而SP435則作為非特異性脂肪酶來使用。反應(yīng)過程中，20：5n-3和10：0以及18:3n-6在Sn-2位置上不斷缺失。10：0的Sn-2位置的存在可能是有用的。這種中鏈