中藥對產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的敏感性研究

1、中藥對產(chǎn)內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的敏感性研究作者：吳國英，欒耀芳，孫進(jìn)學(xué)，王軍，孔祥山【摘要】 目的 對產(chǎn)內(nèi)酰胺酶（ESBL+）大腸埃希菌進(jìn)行中藥體外敏感試驗(yàn)，觀察其結(jié)構(gòu)改變對中藥治療作用的影響。方法 采用瓊脂擴(kuò)散法，以臨床收集的ESBL（+）大腸埃希菌30株為實(shí)驗(yàn)組，非產(chǎn)酶的大腸埃希菌30株為對照組，進(jìn)行體外敏感性研究，所選中藥通過水提、醇提法制備藥液，觀察各種藥物的最低抑菌濃度。結(jié)果 所試中藥體外抑菌效果從強(qiáng)到弱依次為：半枝蓮水提液、蒲公英醇提液、射干醇提液、白頭翁醇提液、半枝蓮醇提液、魚腥草水提液、射干水提液、白頭翁水提液、魚腥草醇提液、蒲公英水提液。對實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)菌的抑菌效果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析

2、，差異無顯著性（P>0.05）。結(jié)論 對ESBL(+)大腸埃希菌引起的感染，在抗生素選擇壓力增大的情況下，中藥可以成為治療的較好選擇，無需實(shí)驗(yàn)室對其確認(rèn)是否產(chǎn)酶。 【關(guān)鍵詞】 中藥；產(chǎn)內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌；非產(chǎn)酶大腸埃希菌；體外敏感性 近年，產(chǎn)內(nèi)酰胺酶（ESBL+）大腸埃希菌引起的各類感染越來越多，治療此種細(xì)菌引起的感染，青霉素類、頭孢菌素類及氨曲南是無效的。細(xì)菌的產(chǎn)酶及突變是否影響中藥的治療作用呢？這一方面未曾見有報道，為此筆者選擇了具有清熱解毒、清熱燥濕作用的中藥通過水提與醇提的方法制備藥液，對ESBL（+）大腸埃希菌進(jìn)行了體外敏感性的對比研究，并對有效中藥進(jìn)行篩選，現(xiàn)報告如下

3、。 1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 中藥選擇 魚腥草：三白草科植物蕺菜Horttuynia cordata Thunb.的干燥地上部分，切段。射干：鳶尾科植物 射干Belamcanda chinensis(L.)DC.的干燥根莖，切片。蒲公英：菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.、堿地蒲公英T.sinicum Kitag.或同屬數(shù)種植物的干燥全草，切段。半枝蓮：唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，切段。白頭翁：毛茛科植物白頭翁Pulsatilla chinensis(Bge.) Regel的干燥根，切薄片。以上藥物均購自

4、我院中藥房。 1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 來自本院門診及病房臨床標(biāo)本中分離的大腸埃希菌（儀器：英國先德SENSITITRE全自動微生物鑒定儀，鑒定符合率95%以上）。選擇經(jīng)鑒定為ESBL（+）大腸埃希菌30株為實(shí)驗(yàn)組，ESBL(-)大腸埃希菌30株為對照組。 實(shí)驗(yàn)方法 2.1 中藥制備 2.1.1 中藥水提液 取中藥魚腥草、射干、蒲公英、半枝蓮、白頭翁各500g，分別置提取容器中，加水適量，浸泡20min，繼續(xù)加水68倍（根據(jù)藥物容積不同，加水量不同），加熱煎煮提取2次（2h, 2h），過濾去渣，合并2次提取液，慢火濃縮至500ml左右（1g/ml），灌封，備用1。 2.1.2 中藥醇提液 取中藥魚腥草

5、、射干、半枝蓮、白頭翁各500g，分別置提取容器中，加65%乙醇適量，浸泡20min，繼續(xù)加提取溶劑68倍量，加熱煎煮提取2次（2h, 2h），過濾去渣，合并2次濾液，回收乙醇。慢火濃縮至500ml左右（1g/ml），灌封，備用1。 2.2 ESBL確認(rèn) 采用NCCLS推薦的抑制劑增強(qiáng)的紙片法進(jìn)行，若任一復(fù)合紙片抑菌圈直徑與單一紙片抑菌圈直徑相比5mm，即判為產(chǎn)ESBLs菌，若<5mm，則判為非產(chǎn)ESBLs菌。所選擇的30株ESBL(+)菌中，頭孢噻肟陽性14株，頭孢噻肟、頭孢他啶二者均為陽性者16株，無單純頭孢他啶陽性菌株。 2.3 菌液制備 挑取培養(yǎng)1824h的純菌落，制成0

6、.5麥?zhǔn)蠁挝?，濃度相?dāng)于(11.5)×108cfu/ml的菌懸液，備用。 2.4 操作 先以打孔法進(jìn)行預(yù)試，瓊脂稀釋法配制濃度。采用2倍稀釋法，配制成份不同濃度的供試藥液，濃度依次為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156，根據(jù)要求加入M-H瓊脂，裝瓶，滅菌，傾注平板。將每個平板分成若干份，編號。取10l菌懸液加到平板表面，放3537孵箱培養(yǎng)，24h觀察結(jié)果，并記錄，以48h無菌生長之最低濃度作為最低抑菌濃度（MIC）。 3 結(jié)果 經(jīng)48h培養(yǎng)觀察，實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)菌在含有不同濃度的中藥平板上表現(xiàn)出不同的生長狀況，見圖1。其MIC結(jié)果見表13（為統(tǒng)計方便

7、，對在濃度為0.5平板上仍有細(xì)菌生長之最終濃度定為1.0）。表1 不同中藥對兩組細(xì)菌的MIC比較 表2 中藥的不同提純方法對實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌的MIC比較表3 中藥的不同提純方法對對照組細(xì)菌的MIC比較從表1中可以看出，中藥魚腥草醇提液、射干水提液、白頭翁水提液、蒲公英水提液對實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)菌的平均MIC值均在0.4以上，筆者認(rèn)為其抑菌作用應(yīng)視為較弱，但其復(fù)方的作用及在體內(nèi)的作用如何尚有待進(jìn)一步研究。魚腥草水提液、射干醇提液、白頭翁醇提液、半枝蓮水提液、蒲公英醇提液對實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)菌在抑菌效果上經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異無顯著性（均P>0.05）。而半枝蓮醇提液對兩組細(xì)菌的MIC經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析

8、，差異有顯著性（P<0.05），醇提液對ESBL(+)大腸的作用優(yōu)于ESBL(-)。 從表、表中可以看出，魚腥草水提液、半枝蓮水提液對兩組細(xì)菌的抑菌效果均優(yōu)于相應(yīng)的醇提液，而射干醇提液、白頭翁醇提液、蒲公英醇提液無論對實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌還是對對照組細(xì)菌抑菌效果均明顯優(yōu)于相應(yīng)的水提液，其MIC值經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異有非常顯著性（均P<0.01）。 4 討論 近年來，由于抗生素的不合理應(yīng)用，使細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，多重耐藥菌株不斷增加，在醫(yī)院的各類感染中，革蘭陰性細(xì)菌仍是主要的感染菌，而其中又以大腸埃希菌為多2。大腸埃希菌是產(chǎn)酶的主要細(xì)菌，其產(chǎn)內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌分離率逐漸增加3。該酶是質(zhì)

9、粒介導(dǎo)的耐藥酶，它不僅能水解青霉素和第一、二代頭孢菌素，還能水解第三代頭孢菌素及氨曲南等，并且ESBL的耐藥基因編碼經(jīng)常與其他的耐藥基因相聯(lián)結(jié)，從而使耐藥性更加復(fù)雜，抗生素選擇更加困難，出現(xiàn)了“抗生素耐藥危機(jī)”，給臨床治療帶來極大難度。目前針對非產(chǎn)酶大腸的中藥研究報道較多，但產(chǎn)酶大腸的諸多改變能否對中藥的抑制作用產(chǎn)生影響，這方面的研究鮮有報道，筆者選擇了具有清熱解毒、清熱燥濕作用的中藥12味，并對其中的魚腥草、射干、半枝蓮、蒲公英、白頭翁進(jìn)行醇提、水提對比，為中藥在對抗特殊耐藥菌方面的作用提供了科學(xué)有效的實(shí)驗(yàn)資料，對中藥的推廣應(yīng)用將產(chǎn)生重要意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 謝秀瓊.現(xiàn)代中藥制劑新技術(shù).北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2