鉀離子通道在不同胎齡大鼠動(dòng)脈導(dǎo)管收縮的作用

1、鉀離子通道在不同胎齡大鼠動(dòng)脈導(dǎo)管收縮的作用    關(guān)鍵字：馬鈴薯 血液透析 切片 血流量 患者 靜脈 穿刺 部位 情況 馬鈴薯 血液透析 切片 血流量     【摘要】  目的  研究大鼠動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌中的三磷酸腺苷（ATP）敏感的鉀離子通道（KATP）及電壓依賴的鉀通道（Kv）的發(fā)育變化及其在動(dòng)脈導(dǎo)管收縮中的作用。方法  通過測(cè)量胎齡19天（早產(chǎn)）及21天（足月）（n=8）胎鼠動(dòng)脈導(dǎo)管血管環(huán)張力及利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)方法測(cè)量動(dòng)脈導(dǎo)管單個(gè)平滑肌細(xì)胞的鉀離子電流，觀察KATP激動(dòng)劑吡拉地

2、爾和KATP阻斷劑格列本脲，Kv阻斷劑4-氨基吡啶對(duì)動(dòng)脈導(dǎo)管收縮和鉀離子電流的影響。結(jié)果  格列本脲可收縮胎齡21天胎鼠的動(dòng)脈導(dǎo)管，但對(duì)19天的無作用。鉀電流可以因吡拉地爾增加，因格列本脲減少，但這種減少的電流在胎齡21天的動(dòng)脈導(dǎo)管要明顯大于19天的。4-氨基吡啶在兩組作用無明顯差異。結(jié)論  本研究數(shù)據(jù)提示在早產(chǎn)兒與足月兒比較，總的Kv電流無明顯差異，但KATP電流明顯減少，KATP通道未發(fā)育成熟，支持KATP在動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌作為一個(gè)氧感受器，是早產(chǎn)兒動(dòng)脈導(dǎo)管未閉發(fā)生率高的原因之一。        【關(guān)鍵詞】

3、60; 動(dòng)脈導(dǎo)管；氧氣；鉀離子通道；早產(chǎn)兒        The role of potassium channels in oxygen-induced contraction of ductus arteriosus in fetal rat of different gestation age                【Abstract】  Objective

4、60; To investigated the role of ATP sensitive potassium channel and voltage-dependent potassium channel in oxygen-induced contraction of ductus arterioses of rat. Methods  Isometric force of contact tissue and potassium current in single smooth muscle cells of ductus arteriosus were measured in

5、 two groups of rats of 19th (premature) and 21st (mature) gestation age respectively. The effects of pinacidil(KATP activater)， glybenclamide (KATP inhibitor)， and  4-aminopyridine(KV inhibitor) were investigated.Results  glybenclamide contracted ductus arteries in 21st group but not in 19

6、th group. Potassium current increased by applying pinacidil in the perfusion solution and decreased by glybenclamide.The change of the currents， together with the depolarization of the membrane potential were significant greater in 21st group then in 19th group. No significant different effect of 4-

7、aminopyridine was observed between two groups.Conclusion  KATP but not KV channel may be one of the O2 sensors in ductus arterioses. It was underdeveloped in premature fetus. and participate in their poor reaction to oxygen and high incidence of patent ductus arteriosus.     

8、;   【Key words】  ductus arteriosus； oxygen； potassium channel； premature fetus        新生兒的動(dòng)脈導(dǎo)管通常在生后數(shù)小時(shí)到數(shù)日關(guān)閉。出生后隨著呼吸的開始，血氧分壓升高是動(dòng)脈導(dǎo)管收縮的重要原因。早產(chǎn)兒動(dòng)脈導(dǎo)管對(duì)氧濃度變化的反應(yīng)欠佳，與早產(chǎn)兒動(dòng)脈導(dǎo)管對(duì)氧的敏感性尚未成熟有關(guān)。提高灌流液氧分壓可引起離體動(dòng)脈導(dǎo)管收縮。這種氧氣引發(fā)的動(dòng)脈導(dǎo)管收縮的機(jī)制尚不明確。氧氣誘導(dǎo)血管內(nèi)皮釋放內(nèi)皮素是使動(dòng)脈導(dǎo)管收縮的原因之一1。Roulet和C

9、oburn2發(fā)現(xiàn)血氧分壓升高可引起細(xì)胞膜去極化。研究發(fā)現(xiàn)ATP依賴的鉀通道（ATP-dependent K channel，KATP，）阻斷劑格列本脲，可收縮動(dòng)脈導(dǎo)管；而KATP開放劑克羅卡林，可以拮抗氧氣引發(fā)的動(dòng)脈導(dǎo)管收縮3。因此，筆者推測(cè)富氧可以關(guān)閉KATP，從而使平滑肌細(xì)胞膜去極化。但是Tristani-Firouzi等4發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈導(dǎo)管也存在著電壓依賴的鉀通道（voltage-dependent K channel，Kv），并在富氧的條件下關(guān)閉，因此他們認(rèn)為動(dòng)脈導(dǎo)管上的氧感受器是Kv。KATP和Kv在動(dòng)脈導(dǎo)管收縮中的作用仍然沒有定論。在我們以前的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，氧氣引發(fā)的動(dòng)脈導(dǎo)管收縮現(xiàn)象只在

10、胎齡21天的胎鼠動(dòng)脈導(dǎo)管出現(xiàn)，而在19天的不能引出5。在動(dòng)脈導(dǎo)管中作為氧感受器的通道，在早產(chǎn)兒應(yīng)該尚未發(fā)育成熟。因此，本研究的目的是了解胎鼠動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌中KATP和Kv發(fā)育情況及它們?cè)趧?dòng)脈導(dǎo)管收縮中的作用，以探明動(dòng)脈導(dǎo)管的收縮機(jī)制。        1  對(duì)象與方法        1.1  對(duì)象  未生育過的Wister鼠，過夜交配后若在陰道拭子發(fā)現(xiàn)有精子則初步判斷受孕并定為胎齡第0天（足月21.5天）。胎齡19或21天時(shí)用苯巴比妥(50 mg/

11、kg)腹腔麻醉母鼠后剖腹取胎鼠。整個(gè)過程遵循美國(guó)生理協(xié)會(huì)的相應(yīng)規(guī)則。所有試劑及藥品均來自美國(guó)Sigma公司。         測(cè)量張力使用完整動(dòng)脈導(dǎo)管環(huán)  分離出胎鼠的縱隔組織并置于HEPES緩沖液中。HEPES液成分(mM)：NaCl， 142； KCl， 5； CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； HEPES， 5； 用NaOH 滴定到pH 7.4，再用100%氮?dú)?N2)平衡。在解剖顯微鏡下從胸腔取出動(dòng)脈導(dǎo)管，制備成0.40.6mm長(zhǎng)的血管環(huán)段，然后放于37的浴槽。 &#

12、160;        電生理實(shí)驗(yàn)使用新鮮分離的單個(gè)平滑肌細(xì)胞  所有用于制備和保存單個(gè)動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞的液體均以100%N2平衡。動(dòng)脈導(dǎo)管和肺動(dòng)脈從胸腔取出后放置于去鈣的Hanks溶液。Hanks液成分(mM)：NaCl 138.8， KCl 5.4， NaH2PO4 1.2， MgCl2 0.5， HEPES 10， EGTA 0.1， 用1M NaOH滴定到pH 7.4。然后把血管剪成小片、置于沒有EGTA的Hanks消化液，其中含有木瓜蛋白酶0.4mg/ml， 二硫蘇糖醇 0.19mg/ml， 以及牛血清白蛋白0.2mg/m

13、l；在37水箱中消化58min，再置于沒有EGTA、含有膠原酶0.25mg/ml的Hanks液，37消化57min。再把膠凍樣的組織用毛細(xì)吸管移至加有10 mg/ml葡萄糖的普通Hanks液并保存在冰中，實(shí)驗(yàn)開始前輕輕攪動(dòng)即可獲得單個(gè)細(xì)胞。        1.2  方法       血管張力測(cè)量  按照常用的等容收縮方法測(cè)量血管張力。用兩根直徑25m的鎢絲穿過血管腔，通過壓力傳感器(Leonia公司Kulite半導(dǎo)體)接到肌動(dòng)描記器，并記錄等容收縮的張力。

14、實(shí)驗(yàn)開始后，用Krebs-Henseleit（K-H）液以10 ml/min的速度灌洗。K-H液成分（mM）： NaCl， 118； KCl， 5； CaCl2， 1.5； glucose，6； MgCl2， 1； NaHCO3， 24； NaH2PO4， 0.436，用95%N25%CO2氣體平衡，使浴槽中灌洗液pH值為7.387.42；氧分壓2225mmHg；二氧化碳分壓3542mmHg。在使用高鉀溶液(鉀濃度 50 mM)時(shí)，用等摩爾的KCl替代NaCl。        記錄血管軸長(zhǎng)，兩條鎢絲之間的距離及牽拉開始時(shí)的牽引力。以牽

15、引力(mN)除以血管軸長(zhǎng)（mm）表示血管壁張力（mN/mm）。對(duì)19和21天胎齡的標(biāo)本，調(diào)節(jié)其基礎(chǔ)張力分別到0.30.5mN/mm (平均0.4±0.1)和 0.60.8mN/mm (平均0.7±0.1)。        采用3種方法使動(dòng)脈導(dǎo)管環(huán)收縮：4M格列本脲（KATP 通道阻斷劑）；10mM 4-氨基吡啶（4-AP）（Kv阻斷劑）；以及50mM KCl。格列本脲和4-AP均溶解在K-H液中。         膜片鉗實(shí)驗(yàn)  低氧液以

16、6ml/min 的速度灌洗，組織池中的氧分壓由血?dú)鈾C(jī)（Ciba Corning 280）測(cè)定，間隔5min采樣，連續(xù)3次保持在3035mmHg時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞放置于操作池中，選擇紡錘狀、表面光滑、折光性好的平滑肌細(xì)胞。電極內(nèi)液成分(mM)：KCl 20， KOH 120， MgCl2 2， EGTA 10， HEPES 5， Mg-ATP 1或5， aspartate 60 (pH 7.4)。灌流液成分(mM)：NaCl 143， KCl 5.4， NaH2PO4 0.33， MgCl2 0.5， HEPES 5， NaOH調(diào)節(jié)pH到7.4。灌流液用100%氮?dú)馄胶?。利用二甲亞砜溶解KATP激

17、動(dòng)劑吡拉地爾和KATP 通道阻斷劑格列本脲，并使后二者在灌流液中的濃度分別為110M和4M。灌流液中二甲亞砜的濃度不超過0.2%。        電極后尖端阻抗為56M。調(diào)整微推進(jìn)器，完成G封閉后，副壓吸引形成全細(xì)胞結(jié)構(gòu)。利用Axopatch 200B 放大器，由 pClamp8.2 發(fā)放刺激脈沖，采樣頻率為10kHz，低通濾波頻率為2kHz，記錄靜息膜電位及電流。刺激方案為：保持電位在-70 mV使鉀電流失活，從-80mV到+60 mV范圍，階躍10mV， 刺激頻率0.1 Hz。電流密度表示為電流與細(xì)胞膜容積之比，單位pA/pF。被

18、吡拉地爾激活并被格列本脲抑制的電流即是KATP 電流。        1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  在Stateview及Clamfit分析軟件下處理結(jié)果。取電流時(shí)程的最后400ms數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。未配對(duì)的兩組均值比較采用t檢驗(yàn)。對(duì)藥物反應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用配對(duì)t-檢驗(yàn)和分析變量的重復(fù)測(cè)定。P<0.05提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。        2  結(jié)果      

19、;  2.1  動(dòng)脈導(dǎo)管張力  高鉀(50mM)使細(xì)胞膜去極化，在兩組(n=8).均可使動(dòng)脈導(dǎo)管收縮（P>0.05）；在兩組均可觀察到4-AP引起的血管收縮（P>0.05）；只在21天組可見由格列本脲引起的動(dòng)脈導(dǎo)管收縮(P<0.05)。        2.2  動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞鉀電流  在生理?xiàng)l件下不同血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度約為1.54mM6，7。但是在低氧環(huán)境下動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度未見報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)中選擇1mM和5mM二種濃度作為電極液來測(cè)量KA

20、TP 電流。當(dāng)使用ATP濃度為5 mM的電極液時(shí)，兩組均顯示被格列本脲阻斷的鉀離子電流最小，提示在這時(shí)KATP 通道是關(guān)閉的。同時(shí)，筆者還觀察了吡拉地爾和格列本脲的作用。即使在5 mM ATP 內(nèi)液的情況下，吡拉地爾仍然可以有效地激活鉀離子通道。因?yàn)樵诟邼舛葧r(shí)(>100M)吡拉地爾也會(huì)激活KCa通道8，故在用吡拉地爾之前常規(guī)加入1 mMTEAC 以減少誤差。        在21天組，由10 M 吡拉地爾激活的鉀電流比19天組明顯增多。在兩組中均發(fā)現(xiàn)10 M 吡拉地爾激活的鉀電流最大，濃度繼續(xù)升高并沒有同期增多的電流。被格列本脲

21、阻斷的鉀電流大小與被10 M 吡拉地爾激活的鉀電流大小相等。這種電流在21天組明顯大于19天組。         當(dāng)使用1 M ATP 作為電極液時(shí)，4 M 格列本脲可明顯抑制鉀電流， 提示在這種條件下KATP 是開放的。而且這種電流在21天組明顯大于19天組（P <0.05）。吡拉地爾可激活鉀通道，而且這些被激活的電流可以被格列本脲阻斷，阻斷的電流比激活的稍大，也表明在基礎(chǔ)條件下，有部分KATP 是開放的。這種被阻斷的鉀離子電流在足月組也明顯高于早產(chǎn)組。       

22、 兩組的膜電位沒有差別(足月組-40.7±3.3 mV，早產(chǎn)組-41.5±4.0 mV)。格列本脲可明顯改變單個(gè)細(xì)胞膜電位，并且在兩組間有明顯差異(足月組33.3±3.3 mV，早產(chǎn)組8.2±2.8 mV，P<0.01)。        3  討論        細(xì)胞內(nèi)ATP濃度低時(shí)KATP 通道開放9，這時(shí)給予格列本脲可以使之關(guān)閉。如果有較多的KATP 通道被關(guān)閉，可以導(dǎo)致細(xì)胞膜的去極化，從而開放電壓依賴的鈣通道，增加

23、細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，使血管平滑肌收縮。有報(bào)道格列本脲可以收縮足月新生兔的動(dòng)脈導(dǎo)管3。本實(shí)驗(yàn)中，格列本脲也可使足月大鼠的動(dòng)脈導(dǎo)管發(fā)生明顯收縮。這些數(shù)據(jù)提示在低氧環(huán)境，成熟胎鼠動(dòng)脈導(dǎo)管KATP是開放并且有功能的。但在未成熟胎鼠卻看不到這種格列本脲引起的動(dòng)脈導(dǎo)管收縮現(xiàn)象，提示在未成熟胎兒動(dòng)脈導(dǎo)管的KATP 是無功能或者是未發(fā)育完善的。在我們以前的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了氧氣可以使胎齡21天的大鼠動(dòng)脈導(dǎo)管收縮但對(duì)19天的無效；而且未成熟胎兒的血管收縮系統(tǒng)，包括平滑肌細(xì)胞膜的去極化、細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加以及細(xì)胞內(nèi)鈣活化收縮蛋白等與成熟胎兒比較沒有明顯差別，但對(duì)血氧變化的感應(yīng)機(jī)制不成熟5。這些結(jié)果支持KATP 是動(dòng)脈導(dǎo)管的氧

24、感受器之一。因?yàn)?-AP引起的收縮在兩組無明顯差別，提示在早產(chǎn)鼠動(dòng)脈導(dǎo)管的總的Kv通道與成熟鼠沒有區(qū)別。當(dāng)然，因?yàn)镵v通道有很多亞類， 在未成熟胎兒的動(dòng)脈導(dǎo)管也可能存在某些KV亞類發(fā)育不完善，尚不能完全排除KV 也是動(dòng)脈導(dǎo)管的氧感受器之一。        KATP 通道的活性與細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）， 二磷酸腺苷(ADP)和其他二磷酸核苷的濃度及比例有關(guān)10。在缺氧時(shí)血管平滑肌組織ATP濃度是否降低仍無定論。以前的實(shí)驗(yàn)顯示，在動(dòng)脈導(dǎo)管組織，當(dāng)灌流液從低氧改到富氧狀態(tài)后，由340nm 激發(fā)的自發(fā)熒光強(qiáng)度雖然降低得不多但具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

25、3。提示熒光底物（如吡啶核苷酸）濃度在低氧環(huán)境中因?yàn)闊o氧代謝而有所增加。Shigemori11提出低氧環(huán)境可以明顯降低門靜脈和肺動(dòng)脈中的ATP濃度；但Leach等6在報(bào)告中指出， 在靜息狀態(tài)且沒有受到牽拉的動(dòng)脈，低氧并不會(huì)明顯降低其組織ATP濃度。在生理狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度為1.5 4mM6，7。在本研究中，筆者選擇了兩種ATP濃度作為吸液管內(nèi)液：1mM和5mM。在吸液管內(nèi)液ATP濃度為1mM時(shí)，格列本脲可以明顯阻斷鉀電流，而在5mM組則未見此現(xiàn)象。這表明 KATP 通道在1 mM ATP這表明KATP 通道在1 mM ATP環(huán)境中是開放的，而在5 mM ATP 環(huán)境中是被抑制

26、的。有報(bào)道當(dāng)ATP濃度在10200M時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞的KATP 電流可以有一半被阻斷10。本研究也發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞，較高濃度ATP可以阻斷其KATP 電流。在缺氧狀態(tài)時(shí)的ATP濃度改變，可以改變KATP通道的活性，從而使動(dòng)脈導(dǎo)管擴(kuò)張。但是不同部位血管組織的KATP 通道對(duì)ATP的敏感性可能是不同的10。        本研究中，被吡拉地爾激活、格列本脲阻斷的鉀離子電流在足月組明顯大于早產(chǎn)組。表明在早產(chǎn)組動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞膜上的KATP 通道尚未發(fā)育成熟。有人可能會(huì)認(rèn)為在早產(chǎn)組KATP 通道也是存在的，只是被1 mM的ATP所

27、抑制了；但實(shí)際上吡拉地爾在3 mM ATP 的條件下仍然可以激活KATP 電流10，12，13。        胎鼠動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞膜電位與文獻(xiàn)報(bào)道值近似2。與張力實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，由格列本脲引起的膜電位的降低在足月組明顯大于早產(chǎn)組。有報(bào)道在完整動(dòng)脈導(dǎo)管，去極化到15 mV可以引起最大收縮的25%的收縮，去極化到21 mV則引起完全收縮。雖然格列本脲對(duì)單個(gè)細(xì)胞膜電位的影響與整體組織的可能有差異，我們的研究也提示了格列本脲引起的去極化在早產(chǎn)組沒有足月組明顯。        總之，

28、本研究結(jié)果表明：在未成熟胎兒的動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞膜上的ATP依賴的鉀離子通道是未發(fā)育完善的。本研究結(jié)果支持ATP依賴的鉀離子通道是動(dòng)脈導(dǎo)管平滑肌細(xì)胞膜上的血氧感受器之一的假設(shè)。也支持在早產(chǎn)兒KATP的發(fā)育不成熟是在其動(dòng)脈導(dǎo)管觀察不到氧誘發(fā)的收縮現(xiàn)象的原因之一的假設(shè)。 【參考文獻(xiàn)】    1  Jing S， Nakanishi T， Gu H， et al. The Role of Endothelin in Oxygen-induced Contraction  of the Ductus Arteriosus in the Rabbit a

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