單克隆抗體制備中篩選雜交瘤細(xì)胞的原理

1、貓郎356%儂酣、 加89628”,藻理部編單克隆抗體制備過(guò)程中篩選雜交瘤細(xì)胞的原理和方法單克隆抗體制備過(guò)程中，有兩次篩選過(guò)程，第一次是選出雜交瘤細(xì)胞（用選擇培 養(yǎng)基），第二次是進(jìn)一步選出能產(chǎn)生我們需要的抗體的雜交瘤細(xì)胞。第一次篩選的原理和方法：細(xì)胞融合后，雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)是第一次篩選的關(guān)鍵。普遍采用的HAT選 擇性培養(yǎng)液是在普通的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中家次黃喋吟、氨基蝶吟和胸腺嚓咤核甘酸。 其一居室細(xì)胞中的DNA合成油兩條途徑：一條途徑是生物合成途徑（“D途徑”），即由氨基酸及其其他小分子化合物合 成氨基酸，為DNA分子的合成提供原料。再此合成過(guò)程中，葉酸作為重要的輔酶參與 這一過(guò)程，而HA

2、T培養(yǎng)液中氨基蝶吟是一種葉酸的拮抗物，可以阻斷DNA合成的D途 徑。另一條途徑是應(yīng)急途徑（“S途徑”）,她是利用次黃口票吟一一鳥嗯吟磷酸核甘 轉(zhuǎn)移酶和胸腺嗓咤核昔激酶催化次黃喋吟和胸腺嚓咤生成相應(yīng)的核甘酸，兩種酶缺一 不可。因此，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的效應(yīng)B細(xì)胞核兩個(gè)效應(yīng)B細(xì)胞融合的D途徑被 氨基蝶吟阻斷，隨S途徑正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液中增殖的能力，一般10天左右 會(huì)死亡。對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞而言，由于通常采用的骨髓瘤細(xì)胞是次黃 喋吟-鳥喋吟磷酸核甘轉(zhuǎn)移酶缺陷型細(xì)胞，因此自身沒有S途徑，且D途徑乂被氨基蝶 吟阻斷，所有在HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤細(xì)胞與效應(yīng)

3、B細(xì)胞 相互融合形成的雜交瘤細(xì)胞，既具有效應(yīng)B細(xì)胞的S途徑，乂具有骨髓瘤細(xì)胞在體外 培養(yǎng)液中長(zhǎng)期增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來(lái)，并不斷增殖。第二次篩選的原理和方法：在單克隆抗體的生產(chǎn)過(guò)程中，由于效應(yīng)B細(xì)胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT培養(yǎng)液 第一次篩選出的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體存在差異，必須對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行第二次篩 選，選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞。二次篩選通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方 法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，是每孔細(xì)胞不超過(guò)一個(gè)， 通過(guò)培養(yǎng)讓其增殖，然后檢測(cè)各孔上清液中的細(xì)胞分泌的抗體，上清液可與特定抗原 結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。陽(yáng)性孔中的細(xì)胞還不能保證是來(lái)自單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)進(jìn)