基因修飾小鼠應(yīng)用于心臟研究的進(jìn)展：從小鼠到人類從基因到臨床

1、基因修飾小鼠應(yīng)用于心臟研究的進(jìn)展：從小鼠到人類，從基因到臨床        【摘要】     基因修飾(敲除、變異和過(guò)度表達(dá))小鼠自90年代初應(yīng)用于心臟學(xué)研究。近十余年來(lái)，利用這一類模型的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)心血管領(lǐng)域所取得的重要進(jìn)展有著突出的貢獻(xiàn)，已經(jīng)成為該領(lǐng)域里具有舉足輕重地位的研究手段。目前，基因修飾小鼠模型的數(shù)量日益增多并已形成系統(tǒng)，有關(guān)的心臟表現(xiàn)型數(shù)據(jù)庫(kù)日趨豐富，多種從整體到分子水平的表現(xiàn)型的研究手段已十分成熟。在今后的心臟研究中，小鼠模型有望對(duì)闡明疾病的分子機(jī)制和

2、探索新的治療途徑起到很大的推動(dòng)作用。     【關(guān)鍵詞】  基因修飾小鼠 臟學(xué) 基因敲除 基因過(guò)度表達(dá)    From mouse to man, from gene to clinic: Progress in heart researchusing genetically modified mouse modelsDu Xiaojun(Experimental Cardiology Laboratory, Baker Heart Research Institute, Melbourne, Austr

3、alia)ABSTRACT: Since the 1990s, models of genetically modified mice (gene knockout, mutation or transgene overexpression) have been increasingly used in heart research. The findings from this class of murine models have contributed significantly to a number of research breakthroughs achieved in the

4、last 15 years. Currently, the number of genetically modified mouse strains has been increasing steadily. These models that targeted a family or a functionally relevant group of proteins have formed systemic tools for research use. The database of mouse cardiac phenotype has been established. Meanwhi

5、le, the research methodology and strategic approach exploring mouse cardiac phentypes at molecular to in vivo levels have been mature. It is expected that the use of this class of genetically targeted mouse models will become increasingly important in future research.KEY WORDS: genetically modified

6、mouse; cardiology; gene knockout; gene overexpression在破譯了人類DNA編碼序列之后，科研人員面臨的更艱巨的任務(wù)是探討基因在生命健康及疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，從而尋求疾病診治的新途徑。目前開(kāi)展這方面研究的重要手段之一是已廣泛應(yīng)用的基因修飾小鼠。近十余年的研究證實(shí)，這一類模型的應(yīng)用對(duì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新近取得的重要進(jìn)展有著突出的貢獻(xiàn)。因此，Rario Capecchi，Martin Evans和Oliver Smithies榮獲了2007年度諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，以表彰他們?cè)诘於☉?yīng)用小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行特定基因干預(yù)原理方面的貢獻(xiàn)。  

7、;  可以用于心臟學(xué)研究的基因修飾小鼠的品系估計(jì)已達(dá)數(shù)千種。隨著數(shù)量的積累，這一類小鼠模型已形成系統(tǒng)。由此獲得的科研發(fā)現(xiàn)對(duì)認(rèn)識(shí)某一蛋白家族或相關(guān)分子在心臟中的作用非常重要。例如，腎上腺素能受體9種亞型的敲除、變異或過(guò)度表達(dá)的小鼠均有報(bào)道1。又如，眾多的參與心肌肥大信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)分子基因的敲除、變異或過(guò)度表達(dá)的小鼠模型均已建立并廣泛應(yīng)用2。同樣，針對(duì)位于細(xì)胞膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)鈣通道、離子交換體、鈣ATP酶等多種鈣信號(hào)調(diào)控蛋白，目前已有20余種基因敲除、變異或過(guò)度表達(dá)小鼠模型3。1  基因修飾小鼠的種類    應(yīng)用胚胎干細(xì)胞單個(gè)基因干預(yù)技術(shù)和不同啟動(dòng)子

8、的選擇，目前可以制造單個(gè)基因敲除、變異基因表達(dá)、基因過(guò)度表達(dá)的小鼠品系4。在敲除某一基因的基礎(chǔ)上敲入(knockin)另一基因的模型可以用來(lái)研究一種基因的功能能否被另一相關(guān)(如用人的基因替換小鼠基因)或變異基因所替代?；蚯萌敕椒ㄒ部梢詫?dǎo)入某種報(bào)告基因(reporter)。兩種以上基因的干預(yù)則可以通過(guò)小鼠品系間雜交而得到(表1，圖1)。目前的趨勢(shì)是制造可調(diào)控性和器官或細(xì)胞特異的基因干預(yù)小鼠模型，從而避免其他非特異性的影響或影響小鼠胚胎發(fā)育而無(wú)法得到成年動(dòng)物4。表1  基因修飾小鼠的種類（略）Table 1  Types of genetically modified mou

9、se models圖1  不同小鼠品系間雜交(crossbreeding)可供研究基因(蛋白質(zhì))之間的相互作用以及心臟病的基因治療。例如在探討基因治療心力衰竭方面，品系間雜交方法可以研究一種提高心肌收縮性的基因干預(yù)能否糾正某一種基因干預(yù)所引起的心肌病和心力衰竭（略）Fig.1 Crossbreeding of strains of mice wtih specific gene targeting allows for investigating genegene (or proteinprotein) interactions or explorating gene therapy

10、 of heart disease, such as heart failure. A: Depicted are two strains of genetically modified mice with cardiac phenotypes of either cardiomyopathy and heart failure (indicated by yellow colour) or a markedly enhanced myocardial contractility (indicated by red colour). B: Crossbreeding is useful in

11、determining whether the heart failure phenotype seen in the cardiomyopathy strain can be reversed by the specific genetargeting leading to an enhanced inotropy (indicated by blue colour)2  小鼠心臟表現(xiàn)型的研究手段    小鼠心臟重約0.1g，左心室容量約40L，每博心輸出量為20-25L，心率則高達(dá)600次/min。因此，在準(zhǔn)確定量小鼠心臟形態(tài)和功能變化方面對(duì)研究?jī)x器

12、的要求很高。近十余年來(lái)，多個(gè)大公司在科研儀器方面的投入對(duì)小鼠心臟學(xué)研究起到了很大的推動(dòng)作用。在心臟影像學(xué)方面，多個(gè)公司的超聲心動(dòng)影像系統(tǒng)目前均可以達(dá)到相當(dāng)好的分辨率(0.05-0.1mm)(圖2A)。彩色血流或組織多普勒、兩維Strain rate、心臟超聲造影等均普遍或開(kāi)始應(yīng)用于科研中。VisulSonic公司的高分辨率超聲系統(tǒng)可供觀測(cè)胚胎小鼠心臟形態(tài)及功能狀況。核磁共振成像(MRI)的應(yīng)用也時(shí)有報(bào)道。Millar導(dǎo)管公司的超微高保真度壓力和壓力/容積導(dǎo)管以及心臟內(nèi)心電圖電極導(dǎo)管也是開(kāi)展研究的必具設(shè)備(圖2A)。其他常用的儀器還包括D.S.I.公司的監(jiān)測(cè)血壓或心電的Telemetry系統(tǒng)，H

13、arvard Apparatus公司的微型呼吸機(jī)等。    另一方面，近十幾年對(duì)整體小鼠心臟表現(xiàn)型的研究表明，在應(yīng)激或疾病情況下研究小鼠心臟表現(xiàn)型對(duì)于闡明基因在疾病發(fā)生和發(fā)展中的作用至關(guān)重要5。常用的小鼠心臟疾病模型包括主動(dòng)脈縮窄 (壓力超負(fù)荷)、容量超負(fù)荷、心肌缺血/再灌注、心肌梗死等(圖2B)5。自從開(kāi)展小鼠心臟研究以來(lái)，業(yè)已積累了豐富的相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)。研究所必需的大量試劑如抗體、檢測(cè)藥盒、DNA array芯片等均有商品化供應(yīng)。這些均為今后的研究奠定了基礎(chǔ)。3  應(yīng)用基因修飾小鼠模型所取得的重要研究進(jìn)展    與腫瘤、免疫

14、、炎癥等領(lǐng)域一樣，基因修飾小鼠的應(yīng)用與近十幾年來(lái)在心臟學(xué)研究領(lǐng)域中所取得的重要進(jìn)展密切有關(guān)(圖3)?，F(xiàn)分以下幾個(gè)方面簡(jiǎn)述。圖2  A：應(yīng)用心臟超聲影像學(xué)(左)或壓力/容積心導(dǎo)管(右)確定小鼠心臟形態(tài)和功能。圖示小鼠左心室(LV)短軸和長(zhǎng)軸二維影像；B：顯微外科手術(shù)方法造成冠狀動(dòng)脈結(jié)扎(左)或主動(dòng)脈縮窄(右)（略）Fig.2 A: Determination of cardiac toporgraphy and function of mice by echocardiography (Left) or by pressure/volume catheter (right). Imag

15、es are short and longaxis views of the left ventricle (LV) of a mouse. B: Ligation of the coronary artery (left) or constriction of the aortic arch (right) in the mouse by openchest surgery. a: aorta; r.i.: right innominate artery; l.m.: left main carotid artery圖3  目前用小鼠模型進(jìn)行心臟研究的基本途徑是應(yīng)用綜合的研究手段在

16、不同的層次去發(fā)現(xiàn)小鼠的心臟表現(xiàn)型，包括在病理情況下研究心臟形態(tài)和功能改變。這些表現(xiàn)型對(duì)于理解人類心臟病的分子機(jī)制、新的治療靶分子和治療途徑具有重要的價(jià)值（略）Fig.3 Using genetically modified mice, researchers have adopted an integrated physiological approach to explore phenotypes that may bear key information on the regulation of physiology, pathogenesis of diseases and potent

17、ial therapeutic targets3.1  動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制和模型  動(dòng)脈粥樣硬化的病因涉及多種基因和環(huán)境因素，因此較好地模擬臨床病理特征的動(dòng)物模型是研究發(fā)病機(jī)制和探討有效治療方案的關(guān)鍵。嚙齒類動(dòng)物的高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的比值(HDL/LDL)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人類，故不易誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化病變?；诟蓴_脂蛋白代謝而建立的數(shù)種基因修飾小鼠在老齡或某些環(huán)境因素，例如高脂飲食、高血壓、血管內(nèi)皮損傷等的影響下，可以發(fā)生與人類相似的動(dòng)脈粥樣硬化病變。這些模型包括脂蛋白E基因敲除 (ApoE -/-)、低密度脂蛋白受體敲除(LDLR-/-)和表達(dá)變異的Ap

18、oE基因(E3L)6。應(yīng)用這些小鼠模型進(jìn)行的研究極大地促進(jìn)了對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變病因的認(rèn)識(shí)和實(shí)驗(yàn)性治療的探討，已成為最常選用的動(dòng)物模型。3.2  心臟發(fā)生學(xué)及先天性心臟病的分子機(jī)制  應(yīng)用基因敲除小鼠研究心臟胚胎發(fā)生的分子機(jī)制在近年里有了突破性進(jìn)展?，F(xiàn)已確定若干基因在心臟發(fā)生的各個(gè)階段起到關(guān)鍵作用。例如，NKx2.5基因缺失小鼠發(fā)生心房心室間隔缺損和傳導(dǎo)系統(tǒng)障礙7。又如組織轉(zhuǎn)化因子(TGF)影響心臟瓣膜的形成，而心肌的發(fā)生則受到多個(gè)基因的影響，包括ErbB、EF2、SRF、GATA和myocardin等78。新近的研究表明，敲除微小RNA1.2(miR1.2)可能通過(guò)抑制心臟

19、發(fā)生中關(guān)鍵基因之一Hand的mRNA、蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯而干擾心房間隔的形成9。這些研究為深入了解心臟發(fā)生的分子機(jī)制打下了方法學(xué)基礎(chǔ)，也為人類先天性心臟病的分子發(fā)病學(xué)和基因診斷提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3  心肌病的分子機(jī)制  心肌病的發(fā)生與肌節(jié)的結(jié)構(gòu)蛋白、收縮蛋白或收縮調(diào)節(jié)蛋白的基因變異密切有關(guān)。目前已有上百種有關(guān)的基因變異或缺失小鼠模型的報(bào)道。心臟表現(xiàn)型研究證明其中絕大多數(shù)品系的小鼠發(fā)生各種類型的心肌病78，而且許多小鼠心肌病的表現(xiàn)型與人類相關(guān)基因變異所致的心肌病相似。例如，肌凝蛋白重鏈(MHC)的變異導(dǎo)致肥厚型心肌病，而mLIM基因敲除小鼠發(fā)生擴(kuò)張型心肌病10。目前利用

20、小鼠復(fù)制相應(yīng)基因變異已成為確定人類心肌病基因發(fā)病機(jī)制的重要研究手段。    妊娠心肌病的病死率很高，其病因一直不清楚。新近的研究取得了突破性進(jìn)展11。妊娠期間心肌發(fā)生生理性肥大并伴有毛細(xì)血管增生。心肌特異性敲除STAT3的雌性小鼠妊娠時(shí)心肌肥大但不伴有毛細(xì)血管增生，證明了STAT3在介導(dǎo)血管增生中的關(guān)鍵作用。STAT3的另一保護(hù)性作用是抑制氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)某些基因的表達(dá)，如Cathepsin D。Cathepsin D降解在妊娠后期至泌乳期大量分泌的泌乳素，生成16ku的片段。該片段可抑制微血管的生成，因而STAT3敲除小鼠發(fā)生妊娠心肌病11。進(jìn)一步的

21、臨床研究證實(shí)了在小鼠模型上觀測(cè)到的這些分子異常，并驗(yàn)證了應(yīng)用藥物抑制泌乳素的分泌，可以有效地治療妊娠心肌病11。3.4  心肌肥大的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)  生理性和病理性心肌肥大的分子機(jī)制是應(yīng)用基因修飾小鼠的重要研究方面。應(yīng)用表達(dá)組成型活化(constitutively active)和顯性抑制(dominant negative)磷酸肌醇3激酶(PI3K)的基因修飾小鼠的研究證明，胰島素生長(zhǎng)激素(IGF1)/PI3K介導(dǎo)生理性心肌肥大8,12，而多種信號(hào)通路通過(guò)鈣/calcineurin或Gq蛋白/蛋白激酶C(PKC)等導(dǎo)致病理性心肌肥大。Olson的研究組應(yīng)用基因修飾小鼠模型證

22、實(shí)的Calcineurin通路是這一領(lǐng)域的突破性進(jìn)展13。    應(yīng)用基因修飾小鼠模型的一些發(fā)現(xiàn)使我們對(duì)心肌肥大有了全新的認(rèn)識(shí)。例如，以往認(rèn)為1A腎上腺素能受體(1AAR)激活是導(dǎo)致心肌肥大的重要機(jī)制之一。而新近的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度表達(dá)1AAR本身并不引起心肌肥大1，也不加重病理情況下的心肌肥大14。另一重要發(fā)現(xiàn)是在慢性壓力超負(fù)荷情況下，多種基因修飾小鼠心肌肥大程度明顯輕于對(duì)照動(dòng)物，而心室功能可以保持在代償狀態(tài)1517。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)心肌肥大是長(zhǎng)期壓力超負(fù)荷狀況下必須的代償機(jī)制的傳統(tǒng)觀點(diǎn)提出了質(zhì)疑，并提示抑制或逆轉(zhuǎn)心肌肥大可能成為治療心臟病的新目標(biāo)。3.5  心

23、律失常的分子機(jī)制  目前，基因修飾小鼠已成為心臟電生理的主要哺乳類動(dòng)物模型，相應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)理解心律失常發(fā)生及維持的基因和分子機(jī)制，尤其是離子通道病(channelopathy)概念的提出有著重要的貢獻(xiàn)。離子通道病涉及細(xì)胞膜鉀、鈉或鈣通道蛋白的變異。表達(dá)某些細(xì)胞膜離子通道蛋白的小鼠表現(xiàn)出人類相似的心臟電生理乃至心肌顯微結(jié)構(gòu)方面的異常，例如長(zhǎng)或短QT綜合征(LQTS，SQTS)或Brugada綜合征18。許多心肌病小鼠也表現(xiàn)出各種類型的心律失常和心性猝死，為這方面的研究提供了有價(jià)值的模型。    心房纖顫是臨床最為常見(jiàn)的心律失常，其治療方案和療效有待提高。

24、然而對(duì)心房纖顫的分子病因一直不清楚。近年來(lái)已有若干個(gè)小鼠心房纖顫模型問(wèn)世，基因修飾包括心肌特異性過(guò)度表達(dá)TGF、RhoA、腫瘤壞死因子(TNF)或敲除KCNE11920。我們新近的品系間雜交研究發(fā)現(xiàn)，降低心肌病小鼠心肌PI3K的活性可以加重心房擴(kuò)大和心肌纖維化病變，并誘發(fā)心房纖顫21。3.6  細(xì)胞內(nèi)鈣的調(diào)控與心臟病的聯(lián)系  在心肌舒張時(shí)相，衰竭心肌發(fā)生肌漿網(wǎng)內(nèi)儲(chǔ)存的鈣經(jīng)由Ryanodin受體(RyR)控制的鈣通道而外漏，造成舒張期細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高，由此導(dǎo)致心肌舒張不全和心律失常。利用一系列的小鼠模型，Marks的研究組最近證明，幾種RyR結(jié)合蛋白起到了穩(wěn)定RyR鈣通道的作

25、用。在心力衰竭情況下，這些蛋白質(zhì)尤其是FK506結(jié)合蛋白(FKBP12.6)被過(guò)度磷酸化而與RyR分離，從而導(dǎo)致RyR通道功能異常進(jìn)而引起鈣庫(kù)內(nèi)鈣外溢22。循此發(fā)現(xiàn)，目前已開(kāi)發(fā)出數(shù)種RyR鈣通道穩(wěn)定劑，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)具有改善心功能和抗心律失常的作用。3.7  小鼠模型在心臟病基因或細(xì)胞治療研究方面的應(yīng)用  在心臟病基因或細(xì)胞治療研究領(lǐng)域，小鼠模型的應(yīng)用首先是提供了一系列的心臟疾病和實(shí)驗(yàn)工具。心力衰竭的突出問(wèn)題是心肌收縮力減弱。利用基因修飾小鼠模型的研究業(yè)已確認(rèn)，十余種基因干預(yù)可以長(zhǎng)期提高基礎(chǔ)狀態(tài)下的心肌收縮性(表2)。例如過(guò)度表達(dá)腎上腺素能受體(1A、1、2AR)等均可顯著

26、提高心肌收縮性1。然而進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)其中一些品系的小鼠由于特定基因表達(dá)倍數(shù)過(guò)高或隨著年齡增加而出現(xiàn)心肌病理?yè)p害和心肌病，提示基因干預(yù)(過(guò)度表達(dá))具有量效關(guān)系(表2)1,23。有數(shù)種基因干預(yù)小鼠則無(wú)明顯心臟病變而正性肌力作用長(zhǎng)期保持，例如敲除受磷蛋白(phospholamban)，過(guò)度表達(dá)5型腺甘環(huán)化酶或低倍數(shù)過(guò)度表達(dá)2AR(<100倍)或1AAR(<80倍)等。應(yīng)用品系雜交的方法證明，敲除受磷蛋白可以逆轉(zhuǎn)由于mLIM敲除或1AR過(guò)度表達(dá)所引起的擴(kuò)張型心肌病10,24。    松弛素(relaxin)是一生殖生理肽類激素。我們于2003年報(bào)導(dǎo)松弛素基因

27、敲除小鼠隨著年齡增加而出現(xiàn)心肌纖維化并伴有心室舒張功能異常25。而后的研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用人松弛素進(jìn)行治療或利用腺病毒介導(dǎo)的松弛素基因轉(zhuǎn)染均可以逆轉(zhuǎn)動(dòng)物心肌纖維化病變。    心臟病細(xì)胞治療設(shè)想的提出令人鼓舞。然而，目前臨床小規(guī)模實(shí)驗(yàn)療效有限，尚有大量關(guān)鍵的基礎(chǔ)問(wèn)題還待解決，例如移植的干細(xì)胞存活率不理想、分化程度低、與生存的心肌之間的功能匹配不佳等。目前多種小鼠模型是該領(lǐng)域研究的必不可少的工具，例如有免疫缺陷而對(duì)植入干細(xì)胞沒(méi)有排斥反應(yīng)的SCID小鼠，可供監(jiān)測(cè)植入干細(xì)胞的EGFP(定位于胞漿)或Gal(定位于胞核)的轉(zhuǎn)基因小鼠等。應(yīng)用基因修飾小鼠的研究還證明了一些與移植干細(xì)

28、胞存活和向心肌細(xì)胞分化的重要因子，如胰島素生長(zhǎng)因子、AKT等。表2  目前證實(shí)具有正性肌力表現(xiàn)型的一些基因修飾小鼠品系。其中一些品系發(fā)生心肌病而提示基因治療“副作用”的可能（略）Table 2  Strains of genetically modified mice with identified cardiac hyperinotropy phenotype. Some of strians also develop with aging cardiomyopathy indicating sideeffect of gene overexpression4 

29、 研究展望    新一代小鼠模型(即器官或細(xì)胞特異性，可調(diào)節(jié)性敲除或過(guò)度表達(dá))將會(huì)越來(lái)越多地采用，從而避免小鼠胚胎期死亡或一些非特異的心臟表現(xiàn)型?？梢灶A(yù)測(cè)，基因修飾小鼠的應(yīng)用在今后會(huì)日益廣泛。這一類模型已經(jīng)并將更多地用于心臟基因表達(dá)和蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究，包括表觀遺傳學(xué)(epigenetics)、微小RNA(micro RNA)和siRNA4,9,26。    在闡明新的治療概念(proofofconcept)方面，對(duì)基本的心臟病理生理機(jī)制，例如心律失常、心肌纖維化、心肌肥大、心肌病等的研究將會(huì)更多地應(yīng)用小鼠模型，而這些研究將會(huì)導(dǎo)致

30、一些重要的全新認(rèn)識(shí)。一般認(rèn)為小鼠模型上的發(fā)現(xiàn)在推廣到臨床應(yīng)用之前需要在大的動(dòng)物模型(translational models)上予以進(jìn)一步驗(yàn)證。然而已有證據(jù)表明，在某些情況下，實(shí)現(xiàn)科研發(fā)現(xiàn)從“小鼠到人”的直接過(guò)渡是可能的，例如前面述及的產(chǎn)后心肌病病因和臨床治療方案的闡明11。    目前已認(rèn)識(shí)到，小鼠基因背景(即品系)對(duì)表現(xiàn)型有重要的影響27，這對(duì)表現(xiàn)型的解釋以及不同小鼠品系的基因修飾模型之間的比較造成一定困難。然而這一特征為今后研究基因背景對(duì)某一特定基因功能的影響提供了重要的線索和研究手段，值得應(yīng)用基因組學(xué)的研究手段進(jìn)行探討。   

31、 為了加快突破性的科研發(fā)現(xiàn)以及從基礎(chǔ)到臨床或從小鼠到人之間科研成果的轉(zhuǎn)化，需要基礎(chǔ)科研人員與臨床醫(yī)生有更多的交流與合作。這不僅為基礎(chǔ)研究不斷提供新的線索和思路，也有利于加強(qiáng)臨床人員的科研意識(shí)和提高疾病診斷治療的水平。    【參考文獻(xiàn)】  1Du XJ. Sympathoadrenergic mechanisms in functional regulation and development of cardiac hypertrophy and failure: findings from genetically engineered mic

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