淺論人乙型肝炎病毒聚合酶在釀酒酵母中的表達

1、淺論人乙型肝炎病毒聚合酶在釀酒酵母中的表達         【摘要】  目的 嘗試在酵母中表達人乙型肝炎聚合酶蛋白（HBV-Pol），并用鎳基顆粒隊蛋白粗提物進行部分純化。方法 將全長HBV-Pol基因用PCR方法擴增并連接到在釀酒酵母高效表達的質(zhì)粒中。轉(zhuǎn)化株于30培養(yǎng)3 d后進行誘導表達16 h，4下收集蛋白粗提物并用鎳基顆粒進行提純。用免疫印跡技術(shù)檢測表達結(jié)果。結(jié)果 重組的HBV-Pol存在于該型酵母的蛋白粗提物中，該蛋白產(chǎn)物可被Nickel-particle提取。結(jié)論 本研究為實現(xiàn)HBV-Pol在S

2、.c.中的高水平表達提供了可靠依據(jù)，也便于HBV-Pol的生化特性研究以及蛋白純化和抗體制備的進一步開展。 【關(guān)鍵詞】  乙型肝炎病毒; 聚合酶;釀酒酵母 Abstract:Objective  Attempt to express HBV-Pol in yeast expression system and then partially purify the rough extract with nickel-based particle. Methods  Full length HBV-Pol gene was amplified and was

3、introduced into a high effective expression plasmid of Saccharomyces cerevisiae（S.c.）.The transformant was cultured at 30 for 3 days, and then induction was carried out for another 16 hours at 30, and then induction was carried out for another 16 hours at 30. Cell lysis and purification were preform

4、ed at 4. Target protein was detected in harvested rough extract with western blot. Results  The recombinant HBV-Pol was present in rough extract of yeast and could be purified with nickel particle. Conclusions  Results of this study prove that HBV-Pol can be expressed in S.c. yeast and mig

5、ht facilitate the biochemical study, protein purification and antibody preparation of HBV-Pol.   Key words： hepatitis B virus; polymerase; Saccharomyces cerevisiae   乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是全球性公眾健康問題。目前世界上約有3.5 億乙肝病毒攜帶者，其中很大比例將會發(fā)展成嚴重的肝臟疾病例如肝硬化、肝細胞癌及其它綜合征1。   乙肝病

6、毒染色體僅有3 200個左右的堿基對，屬于hepadnaviridae 家族，有極強的肝細胞靶向性2。在乙肝病毒生命周期很重要的一步就是它利用自身編碼的逆轉(zhuǎn)錄酶進行將其染色體復制。乙肝病毒聚合酶蛋白（HBV polymerase, HBV-Pol）是一種多功能酶，具有蛋白始動活性3-5、DNA聚合酶活性、反轉(zhuǎn)錄酶活性6及RNA酶H活性7。它包括了三個結(jié)構(gòu)域，從氨基末端到羰基末端依次是末端蛋白（terminal protein，TP），聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）及RNA酶H（RH）。其中末端蛋白與其它兩個域間由一空白序列隔開。   盡管HBV-Pol在其生命周期中起到至關(guān)重要的

7、作用，但是由于HBV-Pol在異源性表達系統(tǒng)中的表達水平低8、可溶狀態(tài)下極不穩(wěn)定9，協(xié)同表達的分子伴侶對該酶的潛在影響10等原因，關(guān)于該酶的生化研究仍然進展緩慢。Kim 等人在協(xié)同表達的GRP94的情況下，在大腸桿菌內(nèi)表達出麥芽糖結(jié)合蛋白標記的HBV-Pol，并證明其對乙肝病毒的RNA有優(yōu)先結(jié)合的特征11。Qadri 和Siddiqui6在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S.C.）表達系統(tǒng)中利用基于Ty1-his3AI 逆轉(zhuǎn)座子構(gòu)建的質(zhì)粒表達并得到了部分純化的HBV-Pol，該HBV-Pol在一種病毒類似顆粒中可以將Ty1 RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA。然而穩(wěn)定的、不需要分

8、子伴侶協(xié)同的大規(guī)模地在常用異源性表達系統(tǒng)（如大腸桿菌或酵母）中得到完整的HBV-Pol的方法目前仍未見報道。   酵母表達系統(tǒng)在重組蛋白表達研究中得到非常廣泛的應(yīng)用，其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S.c.）又是最常用的酵母菌株，本研究中，6聚體組氨酸標記的全長HBV-Pol在S.c.中進行表達并用鎳基顆粒進行部分純化。免疫印跡的結(jié)果提示在酵母體內(nèi)表達人HBV-Pol是一種可靠地進行大規(guī)模HBV-Pol制備方法，該方法可能會對該蛋白的生化特性研究和純化，以及特異性抗體的研究提供便利條件。   1  材料與方法&#

9、160;  1.1  酶與試劑   pYes2.1topo-His 質(zhì)粒和V5抗體購買自Invitrogen (US)； MagneHis蛋白純化試劑盒購自 Promega (US)； PrimeSTARTM 高保真DNA聚合酶購自TAKARA株式會社 (Japan); T4連接酶及限制性內(nèi)切酶購自New England Biolabs. DNA質(zhì)粒純化試劑盒購自Qiagen (Chatsworth, CA). Saccharomyces cerevisiae（S.c.）菌株(基因型： MATSUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1 flo

10、8-1)購自ATCC公司。 其它藥品均購自Sigma公司。   1.2  質(zhì)粒構(gòu)建   從已經(jīng)發(fā)展成肝細胞癌的慢性乙肝患者部分肝臟切除術(shù)后得到少許肝臟組織，切成小塊后迅速放入液氮保存。十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)蛋白酶K 消化后采用酚-氯仿提取法得細胞DNA12。 HBV-Pol DNA 序列從第2 307到1623堿基對，共843個氨基酸殘基 (GenBank序列號 AF286594) 由PrimeSTARTM 高保真酶進行擴增，引物序列為CPNotIF01: GTT GCG GCC GCA TAA

11、TGG CCC TAT CTT ATC and CPBstBIR01: ATT TTC GAA TTC TCA CGG TGG TTT CCA. pYES2.1topo-His-P 構(gòu)建方法見圖1。于楊，等：人乙型肝炎病毒聚合酶在釀酒酵母中的表達遼寧醫(yī)學院學報  2008年10月，29(5)   圖1  pYES2.1topo-His-P結(jié)構(gòu)如圖所示。全長HBV-Pol序列在酶切位點NotI和 BstBI間連入，pYES2.1TOPO-His-P。V5 抗原和多聚賴氨酸尾位于HBV-Pol 3末端。質(zhì)粒表達受控于 Gal 啟動子，預(yù)計融合蛋白約為96 k

12、D   1.3  酵母轉(zhuǎn)化株篩選   參照試劑盒說明書將純化的pYES2.1topo-His-P 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)酵母。轉(zhuǎn)化株用SC-U (缺少脲嘧啶的最低培養(yǎng)基) 選擇性平板培養(yǎng)基 0.67% 酵母氮基, 2% 碳基, 0.01% (腺嘌呤, 精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸, 色氨酸), 0.005% (天冬氨酸、組氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、纈氨酸) 2%瓊脂進行篩選。   1.4  轉(zhuǎn)化株誘導   從SC-U平板培養(yǎng)基上挑取一個轉(zhuǎn)化株菌落并接種在含

13、有2%的棉子糖或2%葡萄糖15 mL選擇性培養(yǎng)液中(與SC-U plate 成分基本相同，僅缺少脲嘧啶和瓊脂)。 30°C于搖床內(nèi)培養(yǎng)3 d后測定培養(yǎng)液的OD600數(shù)值。更換為誘導培養(yǎng)液(與選擇性培養(yǎng)液成份基本相同,碳源為2%的半乳糖和2%棉子糖)。將得到的酵母細胞用誘導培養(yǎng)液重懸至OD600=0.4，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)1416 h后,1 500 g離心收獲細胞待用。斑點雜交（dot bloting）檢測誘導效果。   1.5  細胞裂解與蛋白純化   酵母細胞用裂解緩沖液懸浮 (50 mM 磷酸鈉, pH 7.4; 5% 甘油; 1

14、 mM PMSF)。等體積酸洗玻璃珠加入裂解液中后，混合物在漩渦混勻器上震蕩30 s, 緊接著冰上孵育30 s。4 min內(nèi)將上述步驟重復4 次?？偭呀庖号cMagneHis 鎳基顆粒混勻510 min。經(jīng)過MagneHis洗滌緩沖液兩次清洗后，用MagneHis洗脫緩沖液將目的蛋白洗脫?？偭呀庖骸⒘鞒鲆航M分及部分純化組分分別用免疫印跡法（western blot）檢測裂解與純化效果。   2  結(jié)   果   本研究中，HBV-Pol基因由從2307 to 1623 的HBV DNA所編碼，具有843個氨基酸殘基。表達產(chǎn)物用

15、免疫印跡法（dot blotting 和western blotting）檢測。            2.1  酵母系統(tǒng)的誘導表達與優(yōu)化   相對于其它微生物，Saccharomyces cerevisiae早已為人熟知的遺傳學特性使得它成為最常用于重組蛋白表達的真核細胞表達系統(tǒng)之一。本試驗中，重組HBV-Pol的表達遵循了兩個策略：一是采用羧基端的6聚組氨酸標記，便于目的蛋白的快速純化。二是將V5抗原(Gly- Lys- Pro- Ile- Pro- Asn-

16、Pro- Leu -Leu -Gly -Leu -Asp -Ser -Thr)融入羧基端的重組蛋白中，便于采用V5 特異性抗體來檢測表達效率。   本試驗采用了斑點雜交（dot bloting）來確定HBV-Pol表達條件優(yōu)化。同時也嘗試了一些公認較好Saccharomyces cerevisiae誘導優(yōu)化策略并進行一些改進。首先，用較長的培養(yǎng)時間來代替較短的過夜培養(yǎng)來獲得較高的細胞密度；其次，預(yù)試結(jié)果表明相同容器內(nèi)（250 mL 錐形燒瓶）較小體積（不大于25 mL）的培養(yǎng)效果要優(yōu)于同條件下正常體積培養(yǎng)液（50 mL）中的培養(yǎng)；最后，采用較大的容器（500 mL），其更大

17、的液體表面可以使搖動培養(yǎng)中的細胞獲得   長期以來關(guān)于人HBV-Pol的研究一直存在很多困難，諸如該蛋白難于在異源性系統(tǒng)中表達及在天然狀態(tài)下純化等。盡管重組的人HBV-Pol 已經(jīng)通過很多方式在不同系統(tǒng)里嘗試過表達和純化，純化出的有活性并可用于生化研究的HBV-Pol仍是難題。   人HBV-Pol是一種多功能的蛋白質(zhì)，在異源性表達系統(tǒng)和在純化過程中極不穩(wěn)定9。但在本研究中，盡管沒有協(xié)同表達分子伴侶，仍然有一小部分完整的HBV-Pol 存在于誘導后轉(zhuǎn)化株的總裂解液中。這部分目的蛋白可以通過鎳基親和層析的方法進行純化。免疫印跡的結(jié)果比較提示這種鎳基顆粒可能

18、適用于大規(guī)模的人HBV-Pol純化。   本研究結(jié)果也證明較短的純化時間是獲得完整人HBV-Pol的另一個重要因素。根據(jù)之前試驗的結(jié)果，鎳基質(zhì)柱層析純化很難得到免疫印跡法可以探測水平的蛋白（數(shù)據(jù)未出示）。鑒于柱層析的時間較長，步驟繁瑣，本試驗采用了鎳基顆粒的方式來進行純化。   人HBV-Pol對于乙肝病毒的染色體復制至關(guān)重要。目前美國FDA通過的6種治療慢性乙型肝炎的藥物中，lamivudine, adefovir dipivoxil, entecavir 和 telbivudine 都是HBV-Pol 的抑制劑13。因此對于該蛋白的研究將會有利于&#

19、160; 1 Shepard CW, Simard EP, Finelli L, et al. Hepatitis B virus infection: epidemiology and vaccination J. Epidemiol Rev，2006,28：112-125.2 Bavand M, Feitelson M, Laub O. The hepatitis B virus-associated reverse transcriptase is encoded by the viral pol gene J. J Virol， 1989, 63：1019-1021.3 Lanford

20、 RE, Notvall L. and Beames B. Nucleotide priming and reverse transcriptase activity of hepatitis B virus polymerase expressed in insect cells J. J Virol， 1995, 69：4431-4439.4 Park SG, Jung G. Human hepatitis B virus polymerase interacts with the molecular chaperonin Hsp60 J. J Virol，2001,75：6962-692

21、8.5 Wang GH, Seeger C. The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis J. Cell，1992,71：663-670.6 Qadri I, Siddiqui A. Expression of hepatitis B virus polymerase in Ty1-his3AI retroelement of Saccharomyces cerevisiae J. J Biol Chem，1999, 274：31359-31365

22、.7 Wei X, Peterson DL. Expression, purification, and characterization of an active RNase H domain of the hepatitis B viral polymerase J. J Biol Chem， 1996, 271：32617-32622.8 Jeong JH, Kwak DS, Rho HM, et al. The catalytic properties of human hepatitis B virus polymerase J. Biochem Biophys Res Commun，1996,