p73基因多態(tài)性及蛋白表達與結(jié)直腸腫瘤關(guān)系的研究

1、p73基因多態(tài)性及蛋白表達與結(jié)直腸腫瘤關(guān)系的研究    【摘要】  目的 探討p73基因的多態(tài)性及蛋白表達與結(jié)直腸腫瘤發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系。 方法 血液標(biāo)本分為3組，包括結(jié)直腸腺癌組、結(jié)腸腺瘤組、結(jié)腸未見明顯異常組，各60例。采用PCRRFLP方法檢測血液標(biāo)本p73基因多態(tài)性。組織標(biāo)本分3組，分別取自結(jié)直腸腺癌病灶處、結(jié)腸腺瘤病灶處、結(jié)直腸腺癌患者的相應(yīng)遠離癌灶的正常黏膜組織，各30例，采用免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤組織中p73蛋白表達情況。 結(jié)果 （1）p73基因多態(tài)性與結(jié)直腸腺癌、腺瘤的發(fā)生有相關(guān)性，且AT/AT基因型的人群易患結(jié)腸腫瘤。（2）p7

2、3蛋白表達與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展有相關(guān)性。 結(jié)論 p73基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生有相關(guān)性，且AT/AT基因型的人群易患結(jié)腸腫瘤。p73蛋白表達的增加或上調(diào)與結(jié)直腸癌相關(guān)。     【關(guān)鍵詞】  結(jié)直腸腫瘤； 基因，腫瘤抑制； 腫瘤抑制蛋白質(zhì)類； 多態(tài)現(xiàn)象，遺傳    結(jié)直腸癌的發(fā)生是黏膜上皮受到遺傳和環(huán)境等多種因素作用、導(dǎo)致多基因改變及相互作用的結(jié)果。已知p53基因是人類腫瘤中的重要抑癌基因，而p73基因作為p53家族的成員，在人類腫瘤中也起著重要作用?，F(xiàn)已確定TAp73與p53類似，也能誘導(dǎo)不可逆的

3、細胞周期停滯、促進細胞凋亡，并且此功能與TAp73激活p53靶基因如Bax、p2l waf1等的轉(zhuǎn)錄有關(guān)1。p73基因包含一個多態(tài)性，在上游起始子AUG外顯子，理論上可能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為可以改變基因表達從而影響p73結(jié)構(gòu)。筆者通過研究p73蛋白在結(jié)腸腺癌組織、腺瘤組織及正常組織的表達水平，探討其與結(jié)腸腺癌的細胞分化程度以及腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。    1  對象和方法    1.1  對象  所有病例均來自福建省立醫(yī)院內(nèi)鏡檢查和外科手術(shù)治療患者，其中結(jié)直腸癌主要指散發(fā)型，排除遺傳性非

4、息肉病性大腸癌（HNPCC）。詳細記錄病人性別、年齡及結(jié)直腸腫瘤易感因素，如家族史、手術(shù)史、飲食等。血液標(biāo)本分為3組，包括腺癌組60例，腺瘤組60例，未見明顯異常組60例。組織標(biāo)本分為3組，分別取自結(jié)直腸腺癌病灶處30例，結(jié)腸腺瘤病灶處30例，結(jié)直腸腺癌患者的相應(yīng)遠離癌灶的正常黏膜組織30例。所有腺癌或腺瘤均經(jīng)過內(nèi)鏡形態(tài)學(xué)及病理組織學(xué)證實。“結(jié)腸未見異?！睘閮?nèi)鏡形態(tài)學(xué)上結(jié)腸黏膜光滑的受檢者。所有組織標(biāo)本均為10%甲醛溶液固定、石蠟包埋。    1.2  方法    1.2.1  PCRRFLP&

5、#160; 取外周血2 mL，用EDTA抗凝，基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa D9081）進行基因組DNA提取，聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性分析（PCRRFLP）。PCR引物（228 bp)：    上游：5CAGGAGGACAGAGCACGAG3    下游：5CGAAGGTGGCTGAGGCTAG3    PCR循環(huán)參數(shù)：95 變性5 min，95 30 s57 45 s72 30 s，進行35個循環(huán)，最后72 延伸10 min。PCR產(chǎn)物中加入1 L限制性內(nèi)切酶Sty1，37 孵

6、育酶切78 h，產(chǎn)物用2%瓊脂糖膠電泳，結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)分析。    1.2.2  免疫組織化學(xué)染色  采用二步法免疫組織化學(xué)染色。p73蛋白陽性物質(zhì)定位于細胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：在顯微鏡中倍視野（10×10）下觀察陽性細胞分布情況，分別取45個獨立的高倍視野（10×40），各計數(shù)200250個細胞，陽性細胞<10%為陰性，陽性細胞>10%為陽性。比較結(jié)直腸腺癌和腺瘤以及遠離病灶正常組織的細胞染色密度。    1.3  統(tǒng)計學(xué)處理&

7、#160; SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。采用2檢驗和Fisher確切概率法分析p73基因的多態(tài)性以及p73蛋白的表達在結(jié)直腸腺癌、腺瘤以及正常組中的差別，P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。    2  結(jié)果    2.1  p73基因多態(tài)性  當(dāng)有AT時，酶切AT為156和72 bp 2個產(chǎn)物，GC型不能被Sty1酶切，仍為228 bp產(chǎn)物（圖1）。p73基因多態(tài)性在結(jié)直腸腺癌、腺瘤組和正常組中的分布見表1。腺癌組和腺瘤組比較，2=1.703，P>0.0125

8、，提示p73基因在腺癌組和腺瘤組基因型頻率分布無顯著差異；腺癌組和正常組比較，2=9.713，P<0.0125，提示p73基因在腺癌組和對照組基因型頻率分布有統(tǒng)計學(xué)意義；腺瘤組和正常組比較，2=5.378，P>0.0125，提示p73基因在腺瘤組和正常組基因型頻率分布無顯著差異。并提示AT/AT基因型的人群易患結(jié)腸腫瘤。    圖1  PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切后瓊脂糖電脈結(jié)果（略）    Fig 1  Restriction analysisof p73 gene  

9、  表1  p73多態(tài)性在腺癌、腺瘤和對照組中的分布（略）    Tab 1  The distribution of the p73 genotypes frequencies    表中數(shù)據(jù)為n(%).  2=10.066，P<0.05.    2.2  p73蛋白在結(jié)直腸組織中的表達情況  p73蛋白表達定位于腺癌細胞的細胞核中，呈灶性或彌漫性分布，在結(jié)腸腺癌中呈陽性表達(圖2)，在腺瘤組及對照

10、組表達減少或不表達（圖3，表2）。    表2  p73蛋白在腺癌、腺瘤和遠離癌灶的正常組織中的表達（略）    Tab 2  The expression of p73 protein in colorectal adenocarcinoma, adenoma and healthy group    表中數(shù)據(jù)為n.  2=15.417，P<0.05.    3  討論 

11、0;  Hamajima等對日本人的研究未發(fā)現(xiàn)p73基因型與結(jié)直腸腺癌患病風(fēng)險有聯(lián)系；Li等對美國人進行頭頸部腫瘤的研究，得出AT/AT基因型的人有著一定的結(jié)直腸腺癌患病風(fēng)險；但Ryan等在p73基因的多態(tài)性研究中得出，AT/AT基因型可能不容易得食管癌的結(jié)論24。這些不同的結(jié)論，可能是基于研究人群的種族、性別、年齡、環(huán)境、社會，甚至是病理學(xué)等因素的差異造成的，也可能是腫瘤的類型不同，易患基因型也不同，這需要更多的病例來證實。A：×100；B：×400.    圖2  腺癌中p73蛋白陽性表達（二步法免疫組織化學(xué)染

12、色）（略）    Fig 2  The positive expression of p73 in colorectal adenocarcinoma    A：腺瘤；B：正常組織.    圖3  p73蛋白陰性表達（二步法免疫組織化學(xué)染色×100）（略）    Fig 3  The negative expression of p73 protein in colorectal adenoma

13、or healthy group(×100)    研究表明，p73在許多腫瘤組織中高表達。Yokomizo等發(fā)現(xiàn)，野生型p73蛋白在膀胱癌中存在過度表達；Tannapfel等利用原位雜交和免疫組織化學(xué)的方法檢測到32%的肝細胞癌組織中有p73基因的高水平表達，且這些表達與患者的預(yù)后有關(guān)，而非腫瘤性肝細胞中p73基因呈低水平表達，提示p73基因的高表達與HCC有關(guān)57。DNA損傷后，E2F1誘導(dǎo)p73在mRNA和蛋白水平表達增加，而E2F1是受CEBP反饋調(diào)節(jié)的。用DNA損傷因子DX損傷細胞后，CEBP從細胞核內(nèi)輸出，解除了對E2F1的抑制，從

14、而促進了p73的表達增加 8。Ozaki認(rèn)為RACK1 （receptor for activated C kinase1）在SAOS2細胞中的異位過度表達能減少p73介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，并能抑制依賴p73的凋亡 9。而依賴p53的轉(zhuǎn)錄激活和凋亡則不受RACK1的影響，pRB則會抑制RACK1的作用。用復(fù)制缺陷的腺病毒表達p73(Adp73)轉(zhuǎn)染細胞株，可提高p73的表達水平，激活目標(biāo)基因p21WAF1。Adp73是有效的細胞毒素因子，能引起細胞周期停滯，誘導(dǎo)凋亡，并且能增加化療的敏感性10。但也有文獻報道，p73蛋白因細胞分化不同而表達不同，而不是因增殖或者腫瘤表達不同。Kamiya等發(fā)現(xiàn)，p73在

15、基底細胞癌和脂溢性角化病中的類似基底細胞中強表達，而在鱗狀上皮細胞癌和脂溢性角化病中的類似鱗狀細胞中弱表達11。本研究也顯示，p73蛋白在結(jié)直腸腺癌中存在高表達現(xiàn)象，在30例的結(jié)直腸腺癌組織中有13例存在高表達，而在腺瘤和正常組織中分別只有3例和2例表達，提示p73蛋白的高表達可能與結(jié)腸腺癌有關(guān)。    【參考文獻】  1 Fang L,Lee S W,Aaronson S A. Comparative analysis of p73 and p53 regulation and effector functionsJ. J Cell Biol

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