從噬菌體表面展示環(huán)狀7肽肽庫中篩選葡萄球菌B型腸毒素抑制劑(1)

1、    從噬菌體表面展示環(huán)狀7肽肽庫中篩選葡萄球菌B型腸毒素抑制劑(1)    】 目的： 擬通過生物淘選從噬菌體表面展示環(huán)狀7肽肽庫中篩選出與葡萄球菌B型腸毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)結(jié)合并能抑制該毒素毒性效應的特異性短肽. 方法： 采用PhageELISA來鑒定所得目的肽的親和性；利用競爭ELISA研究合成肽與SEB mAb競爭結(jié)合SEB的情況；通過動物實驗考察其抑制SEB的超抗原特性和腸毒活性情況. 結(jié)果： 篩選所得短肽在一定濃度范圍內(nèi)可以抑制SEB對鼠脾淋巴細胞

2、的激活；合成肽與SEB質(zhì)量比1601下，合成肽可較好地抑制SEB對乳貓的腸毒活性，并對SEB引起的小鼠致死具有明顯保護作用. 結(jié)論： 得到了能與SEB特異結(jié)合并能抑制SEB超抗原特性和腸毒活性的短肽.【關(guān)鍵詞】 葡萄球菌B型腸毒素；肽庫;篩選;抑制劑0引言葡萄球菌B型腸毒素(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)1是超抗原(SAg)家族的主成員之一，該毒素可以造成食物中毒，嚴重時甚至導致致死性休克. SEB中毒后缺乏特異的治療手段，因此研究SEB的特異高效抑制劑具有重大的意義. 我們利用固相篩選方法，即以SEB作為親和靶標蛋白，從環(huán)狀7mer肽噬菌體文庫中篩選到與

3、SEB結(jié)合，并能抑制該毒素毒性效應的噬菌體克隆. 結(jié)果表明，所篩選環(huán)狀7mer肽在細胞水平上可抑制SEB對小鼠脾細胞的激活，在整體動物水平上對SEB導致的毒性具有一定保護作用.1材料和方法隨機肽庫的擴增、定量按照所附試劑盒說明書進行；純化按QIAprepM13 Handbook進行. 親和靶標蛋白SEB的分離純化與定量按文獻2方法進行. 依據(jù)優(yōu)勢噬菌體陽性克隆序列合成相應的多肽,由軍事醫(yī)學科學院六所合成, 并進行了多肽純化和脫鹽處理,合成多肽的純度達95%以上. 將純化的SEB與0.1 mol/L NaHCO3(pH 8.6)相混合, 制成質(zhì)量濃度為1 g/ L的溶液,取100 L混合液加于酶

4、聯(lián)條微孔進行包板固定，于4過夜；次日棄包被液后，加200 L濃度為 50 g/L BSA于酶聯(lián)孔中進行封閉，37結(jié)合2 h,間隙振蕩；棄封閉液，取100 mL/L TBST液200 L洗滌6次,間隔為5 min/次,然后將10 L肽庫原液加于含有100 L TBST的酶聯(lián)孔中,室溫輕搖過夜;次日棄未結(jié)合的噬菌體,取100 ml/L TBST 200L洗滌10次,間隔為3 min/次,最后加80 L洗脫緩沖液,室溫輕柔吹打10 min后,將洗脫得到的噬菌體轉(zhuǎn)入微量離心管中,立即加入15 L 1 mol/L TrisHCL(pH 9.1)進行中和. 將所得噬菌體進行感染、擴增、純化后進行下一輪篩選

5、. 在后續(xù)的篩選中TBST的濃度增為500 mL/L. 隨機挑取第3輪噬菌體單克隆進行培養(yǎng)后進行PhageELISA分析及DNA序列測定. 將SEB包被酶聯(lián)板，經(jīng)30 g/L BSA封閉后加入培養(yǎng)好的單克隆上清，采用PhageELISA法檢測SEB與噬菌體的結(jié)合情況. ssDNA的提取按照QIAprepM13 Handbook進行，純化好的ssDNA送往上海博大基因公司進行序列測定.1.2.1活性測定 采用競爭抑制ELISA考察多肽與SEB的結(jié)合情況, SEB包被量為25 g. 取100 g/L mAb 100 L,分別與噬菌體單克隆上清200, 100, 50, 25, 0 L，其中不足20

6、0 L的以8.5 g/L NaCl補齊，然后加兔抗鼠抗體標記的HRP顯色，A450 nm比色，觀察競爭效果. 結(jié)果判斷的依據(jù)為A值下降，說明多肽抑制了mAb的結(jié)合. 以鼠脾淋巴細胞為靶細胞，采用噻唑藍（MTT）法評價合成肽對SEB超抗原的體外抑制活性.1.2.2動物實驗 幼貓腹腔接種保護實驗： 所用幼貓體質(zhì)量約為450 g. 將純化SEB 5 g溶解于5 mL生理鹽水，制成實驗對照用液；合成肽與SEB按1601質(zhì)量比進行混合用藥. 實驗用量為每只4 mL，在5 h內(nèi)發(fā)生嘔吐、腹瀉者為陽性. 單純使用SEB的組稱為對照組，使用合成肽與SEB的組稱為實驗組. 合成肽對小鼠的保護實驗3： 實驗所用動

7、物為體質(zhì)量1822 g的雌性BALB/c小鼠，隨機分為4組，每組8只，分別為單純使用SEB組、使用致敏劑D半乳糖（DGal）組、使用SEB DGal synthetic 7mer peptide組與使用SEB DGal組. 合成肽與SEB的比例按照1601進行混合用藥，SEB用量5 g/鼠. 致敏劑D半乳糖（DGal）母液濃度為20 mg/鼠.     統(tǒng)計學處理： 應用SPSS統(tǒng)計軟件，利用單樣本t檢驗對單克隆原種親和性進行分析, 合成肽對小鼠的保護抑制利用成組設計多樣本比較的秩和檢驗進行分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學差異.  

8、;  2結(jié)果            作者：李韓平，周宏，鄭玉玲，鄧小紅，馬茹，姜永強【關(guān)鍵詞】葡萄球菌B型腸毒素Screening inhibitor of Staphyloco         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們

9、。將本室重組表達的蛋白進行CMFF離子交換層析. 純化產(chǎn)物進行SDSPAGE分析，可獲得高純度的SEB(Fig 1), 為證明噬菌體肽庫淘選的有效性，即有富集現(xiàn)象出現(xiàn)，需計算每輪淘選產(chǎn)量，每次加入噬菌體數(shù)固定. 通過3輪淘選發(fā)現(xiàn)，隨著淘選次數(shù)的增加，出現(xiàn)了富集，噬菌體環(huán)狀7肽肽庫第3輪比第一輪的產(chǎn)量高出1.375倍. 經(jīng)過3輪親和篩選，隨機挑選14個分隔良好的單克隆制備原種，進行PhageELISA鑒定，以高出陰性對照5倍的單克隆作為陽性克隆,結(jié)果如Fig 2，其中15為陰性對照. 對噬菌體單克隆原種A450進行單樣本t檢驗，t0.05/2（13）=2.160t=10.85, P0.05，相對

10、于陰性對照A450，噬菌體單克隆原種A450具有顯著性差異. 從以上結(jié)果可以看出，經(jīng)過3輪篩選噬菌體得到了明顯富集，可見親和篩選的方法是有效的，已得到與SEB特異結(jié)合的短肽. 選取10個陽性克隆進行測序 ，推導出相應的氨基酸序列. 即為噬菌體外源蛋白與噬菌體外殼蛋白融合展示的環(huán)狀7肽. 通過篩選得到的陽性克隆序列具有很好的一致性，均為CLPRQSSFC. 2結(jié)果        2.1合成肽對SEB超抗原作用的體外抑制活性合成多肽的純度達實驗求，質(zhì)譜分析測定的分子量與理論值相符，說明合成的多肽結(jié)構(gòu)正確，合乎測試求，可

11、用于生物學活性的檢測和評定. 將與SEB高親和力的噬菌體單克隆原種培養(yǎng)上清做系列稀釋，與SEB單抗進行競爭抑制ELISA實驗，結(jié)果在一定稀釋梯度內(nèi)競爭抑制呈線性上升(Fig 3). 這說明篩選所得短肽與SEB結(jié)合位點與SEB mAb結(jié)合位點一致. 以鼠脾淋巴細胞為效應細胞，MTT法測試，SEB在低濃度下，合成的短肽抑制效果較為明顯，隨著SEB濃度的遞增，這種抑制作用逐漸減弱（Fig 4）.2.2動物實驗結(jié)果幼貓腹腔接種后1 h左右，對照組出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、精神萎靡、行走困難癥狀；18 h后，幼貓開始飲水進食，并恢復好動習性；而實驗組則無上述癥狀的出現(xiàn). 顯示，合成肽可以保護幼貓免受SEB腸毒毒性

12、攻擊，證明篩選所得環(huán)狀7肽有效. 為進一步證明肽的有效性，將合成的肽與SEB混合進行動物實驗. 結(jié)果如Fig 5，秩和檢驗2=18.459, P0.05,可認為利用肽進行保護組存活率優(yōu)于單純使用DGal SEB組，在用藥后的10 h內(nèi)，這種保護作用尤為明顯，隨著用藥時間的延長，保護作用逐漸減弱. 結(jié)果證明，篩選所得肽在一定時間范圍內(nèi)對SEB具有明顯的抑制作用.3討論肽庫技術(shù)是引入組合策略和模擬進化思想，建立起的一種篩選藥物先導化合物的新方法. 從噬菌體表位隨機肽庫中篩選藥物先導化合物，可以快速篩選生物活性肽，這一方法具有傳統(tǒng)的藥物篩選方法無法比擬的優(yōu)越性4.PhageELISA檢測結(jié)果顯示，單

13、克隆原種多數(shù)A450 nm比陰性對照高出910倍，而一般認為高出陰性對照5倍即為陽性，且篩選得到的單克隆序列具有很好的一致性，因此以固相的SEB進行親和篩選是成功的，這也與文獻報道相符5,6. 利用SEB單抗進行競爭抑制，在一定濃度范圍內(nèi)，抑制效率基本呈線性關(guān)系，這就說明篩選得到的短肽與SEB的結(jié)合位點和單克隆抗體與SEB的結(jié)合位點重疊. 已有實驗證明，SEB可促進脾淋巴細胞增殖7，而在本實驗中，SEB的超抗原活性體外實驗證明，在一定濃度范圍內(nèi)合成肽可以抑制脾淋巴細胞的增殖，這就間接證明合成肽對SEB具有較好的抑制作用,這也與文獻報道相一致8. 幼貓腹腔實驗顯示，合成肽對SEB的腸毒活性有較強

14、的抑制作用. 小鼠的致死實驗表明，合成肽可以延緩小鼠死亡時間，表現(xiàn)出一定保護作用. 在用藥的10 h內(nèi)，保護組小鼠沒有出現(xiàn)死亡，而實驗組存活率僅為25%，但隨著時間的延長，保護作用的減弱估計與合成短肽半衰期短，在體內(nèi)不穩(wěn)定，易受體內(nèi)環(huán)境影響發(fā)生降解有關(guān). 【參考文獻】1 雷祚榮著. 葡萄球菌和葡萄球菌素病M. 北京： 中國科學技術(shù)出版社,1992: 1992.2 姜永強，寧保安，鄭玉玲,等. 重組葡萄球菌B型腸毒素超抗原的制備及抗腫瘤活性分析J. 細胞與分子免疫學雜志，2002; 18(4): 323-326.Jiang YQ, Ning BA, Zheng YL, et al. Prepar

15、ation and antitumor activity analysis of recominant SEB J. Chin J Cell Mol Immunol, 2002;18(4):.323-326.3 Miethke T, Wahl C, Heeg K, et al. T cellmediated lethal shock triggered in mice by the superantigen staphylococcal enterontoxin B: critical role of tumor necrosis factor J. Exp Med, 1992;175:91-

16、98.4 秦鑫，趙寧，張英起，等. 人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽的噬菌體肽庫篩選與鑒定J. 第四軍醫(yī)大學學報, 2004; 25（12）：1117-1119.Qin X, Zhao N, Zhang YQ, et al. Isolation and identification of a novel peptide binding to human transferrin receptor from phage display library J. Fourth Mil Med Univ, 2004;25（12）：1117-1119.5 Goldman ER, Pazirandeh MP, Mauro

17、 JM, et al. Phagedisplayed peptides as biosensor reagents J. Mol Recognit, 2000;13(6):382-387.6 Wang G, De J, Schoeniger JS, et al. A hexamer peptide ligand that binds selectively to staphylococcal enterotoxin B: Isolation from a solid phase combinatiorial library J. Pept Res, 2004; 64(2):51-64.7 陳鈺，彭虹，尉承澤，等. 超抗原SEB在同種異體細胞移植小鼠中誘導的免疫耐受及其特征J. 細胞與分子免疫學雜志，2002;18(2):101-103.Chen Yu, Peng H. Immunotolerance and its characteristics induced by SEB i