放射性核素125I與神經(jīng)生長因子的偶聯(lián)及條件優(yōu)化

1、放射性核素125I與神經(jīng)生長因子的偶聯(lián)及條件優(yōu)化         11-03-23 16:24:00     編輯：studa20             作者：陸培松，袁志誠，楊勇，龔愛華，張志堅，湛利平，王鵬，陳波 李巧玉，封云  【摘要】  目的： 探討放射性核素125I與神經(jīng)生長因子（nerve growth facto

2、r,NGF）偶聯(lián)的最優(yōu)反應條件。方法： 采用聯(lián)結(jié)標記法進行125I與神經(jīng)生長因子偶聯(lián)反應，在125I投料量固定為37 MBq的條件下，改變NGF的投料量分別為20，50，100，150 g，同樣的條件下反應后以三氯醋酸沉淀法計算產(chǎn)率。將產(chǎn)物保存于4，于1，2，3，5，7天，2，3，4周時間點檢測產(chǎn)物的放射性化學純度，評價產(chǎn)物的體外穩(wěn)定性。結(jié)果： 當NGF投料量由20 g增加到50 g時，125INGF產(chǎn)率由76.6%迅速增加到79.0%，當繼續(xù)增加NGF投料量至150 g時，125INGF產(chǎn)率僅增加1.2%。經(jīng)過連續(xù)4周觀測，本標記方法的產(chǎn)物125INGF在體外4儲存條件下未發(fā)現(xiàn)明顯脫碘，放射

3、化學純度始終大于80%。結(jié)論： 125I與神經(jīng)生長因子偶聯(lián)的理想原料配比為37 MBq 125I與50 g NGF進行反應，該條件下的產(chǎn)物125INGF放射性濃度為97.31 MBq/ml，放射性比活度為584.6 MBq/mg。 【關鍵詞】  放射性核素；神經(jīng)生長因子； 聯(lián)結(jié)標記法AbstractObjective: To explore the optimal reaction conditions of radionuclides 125I labeling nerve growth factor(NGF). Methods： NGF was radiolabeled with

4、 125I by indirect iodination. Keep the constant dose of 125I to be 37 MBq, the dose of NGF varied as 20, 50, 100, 150 g, yield was figured out by TCA precipitation. Keep product in 4, radiochemical purity at 1 d, 2 d, 3 d, 5 d, 7d, 2 w, 3 w, 4 w was detected by TCA precipitation.  Results： Yiel

5、d grew rapidly from 76.6% to 79.0% while the dose of NGF increased from 20 g to 50 g, with the constant increase of NGF to 150 g, the yield increased only by 1.2%. Within 28 days observation, radiochemical purity of the product is above 80%. Conclusion： The best reaction condition is 37 MBq 125I wit

6、h 50 g NGF, under this condition, activity concentration of 125INGF is 97.31 MBq/ml, radioactivity is 584.6 MBq/mg.Key wordsradionuclides; nerve growth factor; indirect iodination    膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)外胚層的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，是成人顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤。膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，手術幾乎不能做到全切，術后腫瘤復發(fā)率高，是臨床治療難點。我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)生長因子（nerve gr

7、owth factor，NGF）在人腦膠質(zhì)瘤細胞中存在過表達，并且發(fā)生核轉(zhuǎn)位1-3。NGF核轉(zhuǎn)位率與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關。俄歇電子是某些放射性核素發(fā)生電子俘獲衰變過程中產(chǎn)生的一種放射性粒子，具有高線性能量轉(zhuǎn)換（linear energy transfer，LET）及超短射程（小于10 nm）的特點。產(chǎn)俄歇電子的放射性核素必須被輸送進入細胞核內(nèi)發(fā)生衰變產(chǎn)生俄歇電子后才能有效殺傷靶細胞4-7，因此，俄歇電子是理想的靶向制劑彈頭。125I是產(chǎn)生俄歇電子效率最高的放射性核素，一個125I原子發(fā)生衰變可以產(chǎn)生22個俄歇電子。根據(jù)NGF在人腦膠質(zhì)瘤中的表達特點及俄歇電子的放射學特性，我們設計以外源性N

8、GF為“載體”，放射性核素125I為“彈頭”，通過聯(lián)結(jié)標記法得到125INGF，用于人腦膠質(zhì)瘤的靶向治療。通過改變投料量配比，得出了最優(yōu)反應條件，并測定了產(chǎn)物的放射化學純度及體外穩(wěn)定性，為后期的抗膠質(zhì)瘤活性研究提供基礎。    1  材料和方法    1.1  材 料1.1.1  主要試劑硼酸（AR）、硼砂（AR）、二甲基甲酰胺（AR）、三氯醋酸（AR）均購自上海國藥集團，氯胺T（ACS）、硫代硫酸鈉（GR）、重蒸苯（AR）、碘化鉀（AR）均購自阿拉丁試劑公司。重組人NGF購自Sigma公司。高放射性核純

9、度的無還原劑的Na125I溶液由上海欣科醫(yī)藥公司進口分裝。彗星試驗試劑盒由廣西南寧生物公司提供。3(4羥苯基)丙酸N琥珀酰胺酯（BoltonHunter試劑）、Sephadex G10葡聚糖凝膠購自Sigma公司。1.1.2 主要儀器 放射性防護工作臺（揚州邗江），BT100型恒流泵（上海琪特分析儀器公司），萬分之一精密電子天平（上海精密儀器儀表公司），WTL掌上離心機（長沙湘儀），L210型渦旋振蕩器（北京來亨），五通道伽馬計數(shù)器GC1500（安徽中佳）。    1.2 方法1.2.1  125I與NGF的偶聯(lián) 參照Jung等8的方

10、法稱取1 mg BH試劑溶解于1 ml DMF苯中，再取出0.1 ml用DMF苯稀釋至1 ml，即得0.1 mg/ml BH溶液。分裝入Eppendorf管中，10 l（1g）/管，干燥氮氣吹干，-20保存?zhèn)溆谩Ｈ〕?支，加入37 MBq Na125I，20 l 2 mg/ml（40 g）氯胺T溶液，振蕩混勻，室溫反應1 min，加入20 l 5 mg/ml（100 g）硫代硫酸鈉溶液，并向反應體系中加入10 l 10 mg/ml（100 g）碘化鉀溶液，振蕩混勻，終止反應。向反應體系中加入200 l DMF苯，萃取，取出上層有機相轉(zhuǎn)移入一潔凈干燥Eppendorf管中，剩余水相用200 l

11、DMF苯重復萃取1次，合并有機相，用伽馬計數(shù)器分別測量有機相和水相的伽馬計數(shù)CPM。按照以下公式計算得到第一步反應標記率。重復第一次標記反應，使標記效率穩(wěn)定。    標記率=有機相CPM有機相CPM+水相CPM×100%    取4支含有第一步反應產(chǎn)物的Eppendorf管，在通風放射防護工作臺中用干燥氮氣將有機相吹干，分別加入NGF 20，50，100，150 g，以pH8.4 BBS補足反應體系為200 l，振蕩混勻，置冰浴中反應30 min，加入1 mol/L 甘氨酸溶液100 l終止反應。取20 l反應產(chǎn)物和100 l 100 mg/ml BSA溶液加入500 l BBS溶液中，混勻，向其中加入100 l 100%TCA溶液，振蕩混勻，4 12 000×g離心10 min，取沉淀，測量沉淀以及離心前溶液總的CPM計數(shù)，按照以下公式計算第二步反應標記效率。    第二步反應標記效率=沉淀CPM離心前溶液總CPM×100%    總反應