抗原特異性Th17細(xì)胞的分化與調(diào)節(jié)

1、抗原特異性Th17細(xì)胞的分化與調(diào)節(jié) 作者：楊靜, 賈磊, 李麗, 吳長有【摘要】 目的: 探討影響抗原特異性Th17細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)的因素。方法: T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠(DO11.10)CD4+T細(xì)胞, 與同背景正常小鼠的脾細(xì)胞混合, 經(jīng)OVA多肽刺激后, 在不同的Th17極化的培養(yǎng)條件下, 觀察Th17細(xì)胞及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。 結(jié)果: 單純OVA抗原刺激主要誘導(dǎo)特異性Th1型反應(yīng), 在TGF和IL6存在的條件下, 主要誘導(dǎo)Th17反應(yīng); 當(dāng)加入IL23之后, 促進了Th17細(xì)胞的分化。阻斷了IFN和IL4之后, Th17細(xì)胞的百分率明顯增加。LPS可以促進Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生, 但對抗原特異性

2、Th17細(xì)胞的分化沒有明顯的促進作用。結(jié)論: 抗原特異性Th17細(xì)胞是與Th1、 Th2相對獨立的細(xì)胞亞群, TGF、 IL6和 IL23可誘導(dǎo)或促進Th17的分化, 而Th1和Th2細(xì)胞因子抑制其分化。 【關(guān)鍵詞】 Th17 T細(xì)胞亞群 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞因子Abstract AIM: To assess the differentiation and regulation of antigen specific Th17 cells in vitro. METHODS: Nave CD4+ T cells from OVATCRtransgenic mice (OVATCRTg) were

3、isolated and cocultured with splenocytes from normal BALB/c mice under different culture conditions. The expression and production of IL17 and other cytokines were assessed. RESULTS: OVA peptide alone mainly induced Th1 type responses. Addition of TGF plus IL6 induced Th17 response. Furthermore, add

4、ition of IL23 to cell culture could promote the differentiation of Th17 cells. Blocking of IFN and IL4 by neutralizing monoclonal antibodies enhanced the percentage of IL17producing cells. LPS could promote the production of Th1 cytokines but had no significant effect on IL17 expression. CONCLUSION:

5、 Antigen specific Th17 cells are distinct from antigen specific Th1 and Th2 cells. TGF, IL6 and IL23 are the factors responsible for promoting the differentiation and development of Th17 subset, whereas IFN and IL4 have inhibitory effects.KeywordsTh17 cells; T cell subset; flow cytometry; cytokine按照

6、CD4+T細(xì)胞分化和功能特征可以將其分為Th1和Th2細(xì)胞1。Th1型細(xì)胞通過分泌干擾素(IFN)等細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫; Th2型細(xì)胞通過分泌IL4等細(xì)胞因子介導(dǎo)體液免疫2, 3。Th1型免疫反應(yīng)失調(diào), 出現(xiàn)組織損壞和慢性炎癥, 而Th2型免疫反應(yīng)失調(diào), 則導(dǎo)致過敏和哮喘疾病的發(fā)生3。近年來, 在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、 實驗性自身免疫性腦脊髓炎等自身免疫病和過敏原特異性反應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)一種特殊的輔助型T細(xì)胞。這群CD4+T細(xì)胞同傳統(tǒng)Th1和Th2細(xì)胞具有明顯不同的特征: 主要分泌IL17, 表達(dá)控制其分化的獨特的轉(zhuǎn)錄因子孤獨受體（orphan nuclear receptor, RORt）4, 因此命

7、名為Th17細(xì)胞。目前對于此細(xì)胞亞群的研究主要集中于其在疾病的發(fā)生中的作用, 而探討影響抗原特異性Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化因素的報道較少。為此, 我們研究了體外培養(yǎng)體系中, 初始抗原特異性TCRTg CD4+T細(xì)胞, 經(jīng)抗原刺激后, 探討影響Th17細(xì)胞的誘導(dǎo)、 分化和調(diào)節(jié)的因素。為深入研究CD4+T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)和探討自體免疫性疾病等免疫學(xué)機制提供實驗和依據(jù)。1 材料和方法1.1 材料 OVA抗原特異性轉(zhuǎn)基因BALB/c小鼠（DO11.10, TCRTg, 雌性, 68周齡）, 購自實驗動物中心。PerCP標(biāo)記的抗CD4（PerCPCD4)、 APC標(biāo)記的抗IFN(APCIFN)、 PE標(biāo)

8、記的抗IL17(PEIL17)均購自美國BD/Pharmingen公司。FITC標(biāo)記的抗KJ1.26單克隆抗體(mAb) 特異性識別轉(zhuǎn)基因OVA抗原受體表達(dá)的細(xì)胞, 購自Caltag Laboratories（CA)。Recombinant Murine IL6、 human IL2和TGF購自PEPROTECH公司。LPS和布雷菲德菌素(brefeldin A, BFA)購自Sigma公司。antiIFN和antiIL4購自BioLegend公司。IL2、 IFN ELISA kit和 FACS Calibur流式細(xì)胞檢測儀購自BD公司。Mouse IL23、 IL4和IL17 ELISA

9、kit購自R&D公司。RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco公司。小鼠淋巴細(xì)胞分離液購自達(dá)科為公司。ELX 800 Universal Microplate Reader酶聯(lián)免疫檢測儀購自BioTEK instrument.INC德國。1.2 方法1.2.1 TCRTg BALB/c小鼠單個細(xì)胞的制備 簡言之, 取小鼠的脾臟, 研磨, 篩網(wǎng)過濾, 然后經(jīng)小鼠淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心（800 r/min, 30 min）, 收取單個核淋巴細(xì)胞, 計數(shù), 用RPMI1640培養(yǎng)液(含100 mL/L滅活胎牛血清、 50 g/L谷胺酰胺、 100 U/mL青霉素、 100 mg/L鏈霉素、 50 m

10、ol/L2ME)調(diào)整細(xì)胞密度為3109/L。1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 新鮮分離的DO11.10小鼠單個核細(xì)胞與同背景BALB/c小鼠單個核細(xì)胞懸液按14比例混合, 在有/無OVA多肽(OVA 323339, 1 mg/L)、 相應(yīng)細(xì)胞因子(TGF 1 g/L、 IL610 g/L、 IL23 10 g/L或抗細(xì)胞因子抗體IFN5 mg/L、 IL45 mg/L)不同組合的情況下培養(yǎng)4 d后, 新鮮RPMI1640培養(yǎng)液中加入低劑量IL2（10 U/mL）繼續(xù)培養(yǎng)2 d, 收集細(xì)胞, 加入OVA多肽和CD28 (終濃度1 mg/L), 刺激的第1 h后, 加入BFA繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因

11、子染色。1.2.3 ELISA檢測 培養(yǎng)4 d的細(xì)胞, 收集上清液, 低劑量IL2（10 U/mL）懸浮細(xì)胞2 d, 調(diào)節(jié)細(xì)胞密度到3109/L。刺激孔加入OVA多肽和CD28, 每個樣品于96孔培養(yǎng)板上置3個復(fù)孔, 200 L/孔, 37、 50 mL/L CO2培養(yǎng)48 h后, 收集培養(yǎng)上清液, 檢測細(xì)胞因子濃度, 按照ELISA試劑盒說明書操作, 酶聯(lián)檢測儀檢測結(jié)果。1.2.4 細(xì)胞染色 首先進行細(xì)胞表面染色, 簡言之, 細(xì)胞懸液, 加入熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞表面特異性抗原的抗體, 4避光反應(yīng)30 min, 洗滌2次（800 r/min, 8 min）。之后進行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色, 即將待測細(xì)

12、胞用PBS洗滌2次后, 加入40 mL/L多聚甲醛, 室溫固定8 min, 洗滌, 加入含有通透劑的緩沖液4過夜破膜, 加入特異性的胞內(nèi)標(biāo)記mAb, 4避光反應(yīng)30 min, 洗滌2次, 染色緩沖液重懸細(xì)胞, 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進行檢測。1.2.5 FCM分析 應(yīng)用FCM進行檢測。首先設(shè)門于淋巴細(xì)胞, 再以CD4+KJ1.26+雙標(biāo)記細(xì)胞群開窗, CellQuest收集10000個細(xì)胞, FlowJo軟件分析FCM結(jié)果。1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 所獲數(shù)據(jù)用xs表示, 顯著性檢驗采用t檢驗分析。2 結(jié)果2.1 TGF和IL6誘導(dǎo)抗原特異性Th17細(xì)胞的分化 DO11.10小鼠和BALB/c小鼠單

13、個核細(xì)胞懸液, 在OVA多肽和相應(yīng)細(xì)胞因子存在的條件下培養(yǎng), 刺激后檢測細(xì)胞因子的表達(dá)。ELISA結(jié)果表明（圖1A）, 單獨抗原刺激以及加入TGF或者IL6后, 對IL17的產(chǎn)生都無明顯作用, 但TGF和IL6二者協(xié)同則可以明顯促進抗原特異性IL17的產(chǎn)生(P0.01)。流式結(jié)果表明（圖1B）, 單獨OVA刺激主要誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生。單獨加入TGF后, IL17+ T細(xì)胞百分率由2.65%降低到1.77%。單獨加入IL6后, IL17+ T細(xì)胞百分率無明顯變化, IFN+ T細(xì)胞百分率從6.26%降低到3.16%。在TGF和IL6協(xié)同誘導(dǎo)下, 即Th17極化培養(yǎng)條件下, IL17+ T細(xì)

14、胞的百分率明顯升高, 由2.65%升高到4.88%, 同時IFN+ T細(xì)胞百分率由6.26%降低到2.58%。圖1 TGF和IL6誘導(dǎo)抗原特異性Th17細(xì)胞的分化（略）Fig 1 TGF plus IL6 induced the differentiation of Th17 cellsUnstimulated; Stimulated. A: ELISA for IL17; B: Flow cytometry plots were gated on CD4+KJ1.26+ T cells. bP0.01 vs compared to OVA peptide alone.2.2 IL23促進TG

15、F和IL6誘導(dǎo)的抗原特異性Th17細(xì)胞的分化 進一步分析了IL23對Th17分化的影響, 培養(yǎng)條件中加入IL23和/或TGF, ELISA結(jié)果表明（圖2A）, IL17的產(chǎn)生無明顯變化, 但IL23卻能明顯地促進TGF和IL6誘導(dǎo)的抗原特異性IL17的產(chǎn)生（P0.01）。胞內(nèi)染色結(jié)果與之相似（圖2B）。與單純抗原刺激相比, 加入IL23后, 抗原特異性的T細(xì)胞（即CD4+KJ1.26+細(xì)胞）中, IL17+T細(xì)胞的百分率由3.21%下降到2.25%; IL23與TGF協(xié)同作用, IL17+T細(xì)胞的百分率由3.21%下降到2.33%。在Th17極化培養(yǎng)條件中加入IL23, 刺激之后IL17+ T

16、細(xì)胞的百分率由3.21%升高到10.12%, 同時IFN+ T細(xì)胞由6.53%降低到2.82%。2.3 IFN和IL4抑制抗原特異性Th17細(xì)胞的分化 制備脾臟單個核細(xì)胞混合懸液, 在Th17極化條件下培養(yǎng), 加入或不加入IFN和/或IL4。ELISA檢測培養(yǎng)4 d的細(xì)胞上清, 結(jié)果表明（圖3A）, 阻斷了IFN之后, 上清中IFN的表達(dá)下降（P0.01）, 而IL17的表達(dá)水平明顯增高（P0.05）。阻斷了IL4之后, 上清中IL4的表達(dá)下降（P0.01）, IFN的表達(dá)增高（P0.05）, 而IL17的表達(dá)水平降低（P0.05）。當(dāng)同時阻斷了IFN和IL4后, IL17的表達(dá)最高, 差異具

17、有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）。2次培養(yǎng)刺激以后（圖3B）, IL17表達(dá)水平的變化與一次培養(yǎng)相似。胞內(nèi)染色結(jié)果表明（圖3C）, Th17極化培養(yǎng)條件下加入IFN后, IL17+T細(xì)胞百分率由7.44%上升到8.72%, IFN+ T細(xì)胞百分率由2.01%下降到1.39%。加入IL4后, IL17+ T細(xì)胞百分率由7.44%下降到4.29%, 而IFN+ T細(xì)胞百分率由2.01%上升到13.22%。同時加入IFN和IL4后, IL17+T細(xì)胞百分率由7.44%上升到10.13%。圖2 IL23促進TGF和IL6 誘導(dǎo)的抗原特異性Th17細(xì)胞的分化（略）Fig 2 IL23 enhanced Th1

18、7 differentiation induced by TGF plus IL6Unstimulated; Stimulated. A: ELISA for IL17; B: Flow cytometry plots were gated on CD4+KJ1.26+ T cells. bP0.01 vs compared to OVA peptide alone.2.4 LPS對于抗原特異性Th17細(xì)胞的分化無明顯促進作用 單個核混合細(xì)胞懸液在Th17極化條件下加或不加LPS培養(yǎng)后, ELISA檢測2次刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子含量。結(jié)果表明（圖4A）, 中性培養(yǎng)環(huán)境中加入LPS后,

19、細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN的含量升高, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。而在Th17極化培養(yǎng)條件中加入LPS以后, 對IL17的產(chǎn)生無促進作用。FCM檢測結(jié)果（圖4B）與ELISA結(jié)果一致。OVA多肽培養(yǎng)同時加入LPS后, IL17+ T細(xì)胞百分率無明顯變化, 分別為3.20%和3.45%, IFN+細(xì)胞百分率由6.73%明顯升高到10.60%。Th17極化環(huán)境中加入LPS后, IL17+T細(xì)胞百分率由10.52%變?yōu)?.39%, IFN+細(xì)胞百分率無明顯變化, 分別為3.29%和2.83%。1 圖3 IFN和IL4抑制抗原特異性Th17細(xì)胞的分化 （略）Fig 3 IFN and IL4 inhi

20、bit the differentiation of antigen specific Th17 cellsUnstimulated; Stimulated. A: ELISA for IL17, IFN and IL4 for 4 d culture supernatants; B: ELISA for IL17 for secondary culture supernatants; C: Flow cytometry plots were gated on CD4+KJ1.26+ T cells. aP0.05, bP0.01 vs primed without antibody.圖4 L

21、PS對于抗原特異性Th17細(xì)胞分化的作用（略）Fig 4 Effects of LPS on antigen specific Th17 differentiationUnstimulated; Stimulated. A: ELISA for IL17 and IFN; B: Flow cytometry plots were gated on CD4+KJ1.26+ T cells. aP0.05 vs primed without LPS.3 討論 長期以來, 人們一般認(rèn)為CD4+T細(xì)胞被活化、 增殖, 最終將分化為效應(yīng)Th1和Th2細(xì)胞。隨著對自身免疫病研究的深入, 人們發(fā)現(xiàn)很多現(xiàn)象不

22、能用已知的Th1/Th2模式來解釋。直至發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞。有關(guān)Th17細(xì)胞在炎癥和自身免疫性疾病發(fā)生中的重要作用, 最直接的證據(jù)是將EAE患病小鼠的Th17細(xì)胞被動轉(zhuǎn)輸正常小鼠后, 健康小鼠被誘導(dǎo)出嚴(yán)重的EAE6。 目前對于Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究基于多克隆刺激的基礎(chǔ)上。Th17細(xì)胞的分化受許多細(xì)胞因子的調(diào)控。在小鼠的體外實驗?zāi)Ｐ椭? TGF和IL6聯(lián)合作用可以誘導(dǎo)Th17的分化7; IL1和TNF能夠促進TGF和IL6誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞的分化8; IL12家族成員IL23能夠促進Th17細(xì)胞的擴增和維持, 但是, 在體外, 單獨的IL23不能誘導(dǎo)Th17的分化, 只能作用

23、于記憶CD4+T細(xì)胞, 產(chǎn)生IL179。Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IFN和IL4抑制多克隆刺激下Th17細(xì)胞的分化。 本實驗中, 利用T細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠(DO11.10), 探討細(xì)胞因子對Th17細(xì)胞分化的作用, 結(jié)果表明, TGF和IL6對抗原特異性Th17的分化起協(xié)同作用, 細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL17的分泌水平約1200 ng/L, 而IL23能夠促進由TGF和IL6誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞的分化, 使IL17的分泌水平達(dá)到5000 ng/L。IL23單獨作用或者與TGF協(xié)同作用對抗原特異性Th17細(xì)胞因子的產(chǎn)生無促進作用。這一結(jié)果與目前報道的多克隆刺激下的結(jié)果一致。有關(guān)人Th17細(xì)胞研

24、究結(jié)果表明, 部分Th17細(xì)胞同時分泌IFN, 而動物實驗中, Th1 和Th17是截然不同的細(xì)胞亞群10, 本次實驗也證明了這一點。另外, 加入IFN和IL4的中和性抗體之后, 抗原特異性的Th17細(xì)胞的比例增高, 細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL17的分泌水平達(dá)到6000 ng/L, 進一步說明了IFN和IL4對抗原特異性的Th17細(xì)胞有抑制作用。 眾所周知, 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）通過與免疫細(xì)胞的TLR4結(jié)合促進Th1細(xì)胞的分化10。有文獻報道, LPS可以刺激DC分泌多種促炎因子, 在提供外源性TGF的情況下, antiCD3和antiCD28刺激后初始CD4+T細(xì)

25、胞分化為Th17細(xì)胞11。本實驗結(jié)果表明, 在中性環(huán)境下, LPS能夠促進IFN的表達(dá), 但是在Th17極化的培養(yǎng)環(huán)境下, LPS對IL17以及IFN的表達(dá)并無促進作用。其原因可能與以下幾點有關(guān): （1）本實驗采用OVA多肽特異性刺激, 刺激條件與多克隆刺激不同; （2）LPS對IFN的產(chǎn)生有促進作用, 可能在一定程度上抑制了Th17細(xì)胞的分化; （3）Th17極化條件下, 提供的外源性細(xì)胞因子相對減弱了LPS的作用。但其詳細(xì)的機制有待進一步研究。 綜上所述, 本研究結(jié)果證明了初始抗原特異性CD4+T細(xì)胞可以分化為Th17細(xì)胞, 這一過程受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控。本實驗探討了Th17細(xì)胞分化最佳

26、的誘導(dǎo)條件, 為進一步研究Th17細(xì)胞的生物學(xué)活性和功能, 以及其在臨床疾病中的作用提供了理論依據(jù)?！疚墨I】 1 Castellino F, Germain RN. Cooperation between CD4+ and CD8+ T cells: when, where, and howJ. Annu Rev Immunol, 2006, 24(1): 519-540.2 Park H, Li Z, Yang XO, et al. A distinct lineage of CD4+T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17J. Nat Immunol, 2005, 6(11): 1133-1141.3 Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, et al. Interleukin 17producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and