ipt基因促進杜仲遺傳轉化不定芽再生

1、第33卷第6期2011年11月北京林業(yè)大學學報JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITYVol33，No6Nov，2011550025貴州省貴陽市花溪區(qū)貴州大學南校區(qū)農業(yè)生物工程重點實驗室。責任作者：趙德剛，教授，博士生導師。主要研究方向：植物基因工程。電話mail ：dgzhaoyahoocom地址：同上。本刊網址：http ：journalbjfueducnipt 基因促進杜仲遺傳轉化不定芽再生李巖趙德剛（貴州大學貴州省農業(yè)生物工程重點實驗室，貴州大學生命科學學院基因工程實驗室，貴州大學教育部綠色農藥與農業(yè)生物工程重點實驗室）摘

2、要：利用農桿菌介導法，將35S 啟動子驅動的ipt 基因遺傳轉化杜仲，分析ipt 基因對杜仲遺傳轉化不定芽誘導的影響。結果表明：轉ipt 基因及空載體，外植體不定芽的分化率分別為0. 96%和0. 93%，差別不明顯，但轉ipt 基因的單位外植體平均長芽數(shù)為3. 1個，明顯高于對照的1. 9個，進而促進了杜仲遺傳轉化的不定芽的誘導，其不定芽誘導率可達2. 95%，明顯高于空載體對照的1. 68%。本文首次證明：ipt 基因能夠促進轉化困難木本植物杜仲的不定芽誘導，為通過該基因與其他功能基因結合提高杜仲遺傳轉化效率奠定了技術基礎。關鍵詞：異戊烯基轉移酶基因；遺傳轉化；杜仲中圖分類號：Q943.

3、2；S723. 1+32文獻標志碼：A 文章編號：1000-1522（2011）06-0090-04LI Yan ；ZHAO De-gang. Ipt gene promoting shoot regeneration in genetic transformation of Eucommia ulmoides OlivJournal of Beijing Forestry University （2011）33（6）90-93Ch ，11refGuizhou Key Laboratory of Agro-Bioengineering ，Laboratory of Gene Engineeri

4、ng in College of Life Sciences of Guizhou University ，Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Biological Engineering of Ministry of Education ，Guiyang ，550025，PRChinaIn this research ，the ipt gene driven by 35S promoter was transferred into Eucommia ulmoides Olivvia agrobacterium-mediated

5、 transformation ，and the influence of exogenous gene on shoot regeneration was further investigated in the current workThe results showed that compared with control （ipt -free ）line （0. 93%），no significant difference in shoot regeneration efficiency was obtained from the ipt transgenic lines （0. 96%

6、）However ，ipt gene enhanced the shoot number per explant ，which was 3. 1，obviously higher than that of control （1. 9）Thus ipt gene enhanced shoot inductivity of Eulmoides ，which was 2. 95%，evidently high than CK 1. 68%The present research firstly prove that ipt gene can substantially enhance shoot r

7、egeneration of Eulmoides and this lays a foundations for promoting genetic transformation efficiency of Eulmoides Key wordsipt gene ；genetic transformation ；Eucommia ulmoides Oliv杜仲（Eucommia ulmoides Oliv）系杜仲科（Eucommiaceae ）杜仲屬植物，為我國特有的珍稀保護樹種，已列入中國植物紅皮書（稀有瀕危植物）第1卷。杜仲既是傳統(tǒng)名貴中藥，也是溫帶最具開發(fā)利用前景的膠源植物。杜仲的遺傳轉

8、化較為困難，目前僅有趙丹等1關于FPS 基因遺傳轉化杜仲的研究報道。異戊烯基轉移酶（IPT ）催化細胞分裂素生物合成途徑中DMAPP （2'-異戊烯基焦磷酸）和5'-AMP （5'-腺苷-磷酸）縮合和去磷酸化反應，產生異戊烯基單磷酸腺苷，是細胞分裂素生物合成最重要的限速酶2-3之一。ipt 基因來源于根癌農桿菌Ti質粒，編碼細胞分裂素生物合成途徑中的關鍵酶即異戊烯基轉移酶，它能促進煙草（Nicotiana tabacum ）、矮牽牛（Petunia hybrida ）等植物遺傳轉化過程的不定芽誘導，提高轉化效率4-7本文擬將ipt基因遺傳轉化杜仲，探討ipt 基因對杜仲

9、遺傳轉化效率的影響，為利用ipt 基因提高杜仲轉化效率奠定基礎。1材料與方法1. 1供試材料根癌農桿菌，菌株EHA105為本實驗室保存。ipt 基因植物表達載體由本實驗室以pBin19為基礎構建，表達載體圖譜T-DNA 部分見圖1。遺傳轉化中所用植物材料杜仲取自貴州大學校園。實驗中所用PCR 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列如下：ipt P1：5'-ATCGGGTCCAAT GCTGTCCTC-3' ；ipt P2：5'-TGCTTAACTCTGGCC TTGGC-3' ，flp P1：5'-GGGGTACCCAAGTCGACC AATG

10、CCACAATTTGGTATATTATG-3' ，flp P2：5'-CCGATCGAGTTATAT GCGTCTATTTATGTAGG-3' 。圖1植物表達載體T-DNA 結構圖Fig. 1Constructs for plant expression vector T-DNA1. 2農桿菌介導的遺傳轉化杜仲種子去外皮，沖洗30min ，滅菌水浸泡過夜，超凈工作臺中以75%酒精消毒60s ，0. 1%升汞消毒30min ，無菌水漂洗5次。將消毒后的種子接種到MS 基本培養(yǎng)基中。待種胚突破種皮0. 5cm 左右時，將胚剝出，接種到種胚生長培養(yǎng)基中。取20d 齡種胚，將胚

11、軸切成0. 5cm 左右小段，置于分化培養(yǎng)基，黑暗預培養(yǎng)48 72h ，將預培養(yǎng)的外植體投入預先準備好的農桿菌重懸液中，室溫下不斷搖動，使外植體與農桿菌充分接觸，浸泡6 8min ，取出外植體，置于干燥無菌濾紙上吸去多余的菌液，共 培養(yǎng)48h ，此時外植體邊緣及培養(yǎng)基開始長出農桿菌菌落，將材料用濾紙蘸凈，轉入篩選培養(yǎng)基誘導不定芽分化。28d 后比較不同材料的不定芽誘導情況，計算外植體分化率、外植體平均長芽數(shù)及遺傳轉化效率（不定芽誘導率）。外植體分化率=長芽外植體數(shù)/外植體總數(shù) 100%，外植體平均長芽數(shù)=不定芽總數(shù)/長芽外植體數(shù)，遺傳轉化效率（不定芽誘導率）=不定芽總數(shù)/外植體總數(shù) 100%。

12、實驗所用培養(yǎng)基成分見表1。除特殊說明以外，實驗中所用植物培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)+30g /L 蔗糖+7g /L 瓊脂，pH 5. 80，121 滅菌20min 。表1杜仲遺傳轉化培養(yǎng)基Tab. 1Media used for genetic transformation in E . ulmoides培養(yǎng)基號培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基組成1種胚生長培養(yǎng)基MS +2. 0mg /L GA +蔗糖3%+瓊脂粉0. 75%2預培養(yǎng)基MS +蔗糖3%+瓊脂粉0. 75%3共培養(yǎng)基MS +0. 8mg /L 6-BA +0. 1mg /L NAA +50mg /L AS +蔗糖3%+瓊脂粉0. 75%4篩選培養(yǎng)基1M

13、S +0. 8mg /L BAP +0. 1mg /L NAA +50mg /L Kan +100mg /L Timentin +蔗糖3%+瓊脂粉0. 75% 5篩選培養(yǎng)基21. 0mg /L 6-BA +0. 1mg /L NAA +50mg /L Kan +100mg /L Timentin +蔗糖3%+瓊脂粉0. 75%1. 3轉基因植株的檢測以CTAB 法提取杜仲葉片總DNA 。因植物表達載體的T-DNA 中含有flp 基因，分別采用flp 重組酶基因特異引物flp Primer 1和flp Primer 2，以及ipt 基因特異引物ipt Primer 1和ipt Primer 2，

14、進行PCR 擴增檢測。flp 基因PCR 擴增條件為：94 預變性10min ；94 變性1min ，55 退火1min ，72 延伸1min ，共35個循環(huán)；最后72 延伸7min 。ipt 基因PCR 擴增條件為：擴增條件為94 10min ；94 1 min ，58 1min ；72 1min ，共35個循環(huán)；最后72 延伸7min 。PCR 擴增產物在1. 0%的瓊脂糖中進行電泳檢測。 2結果分析2. 1轉基因杜仲flp 基因PCR 分析電泳檢測結果表明（圖2），第5 6道轉化Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲芽及第4道轉化Hsp 18. 2：flp 杜仲芽均擴增出12

15、70bp 的帶，與第3道陽性質粒擴增產物大小一致，而非轉基因對照沒有擴增出特征譜帶。2. 2轉基因杜仲ipt 基因PCR 分析電泳檢測結果表明（圖3），第5、6道轉化Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲芽擴增出了325bp 的帶，與第1道Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 陽性質粒擴增產物大小 圖2轉基因杜仲flp 基因PCR 分析Fig. 2PCR analysis of transgenic E . ulmoides with flp gene注：1. 標準DNA ：DNA 經BamH ，Hind 雙酶切產物；2. 非轉基因對照；3. Hsp 18. 2：flp -

16、35S ：ipt 質粒；4. 轉Hsp 18. 2：flp 杜仲轉基因植株；5 6. 轉Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲轉基因植株。圖3轉基因杜仲ipt 基因PCR 分析Fig. 3PCR analysis of transgenic E . ulmoides with ipt gene注：1Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 質粒；2標準DNA ：100bp DNA Ladder ；3非轉基因對照；4轉Hsp 18. 2：flp 杜仲轉基因植株；5 6轉Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲轉基因植株。一致，而轉化Hsp 18. 2：flp 杜仲

17、芽及對非轉基因對照沒有擴增出特征譜帶。2. 3ipt 基因對杜仲胚軸遺傳轉化不定芽誘導的影響 圖4杜仲遺傳轉化Fig. 4Genetic transformation of E . ulmoides注：1. 遺傳轉化Hsp 18. 2：flp 基因杜仲胚軸不定芽誘導；2. 非轉基因對照杜仲胚軸不定芽誘導；3. 遺傳轉化Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 基因杜仲胚軸不定芽誘導；4. 轉Hsp 18. 2：flp 基因杜仲植株試管苗；5. 非轉基因對照杜仲植株試管苗；6. 轉Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 基因杜仲植株試管苗。由表2，圖4可知，轉化ipt 基因杜仲胚軸

18、外植體分化率略高于轉化空載體對照材料，但差別不明顯，分別為0. 96%和0. 93%。但在單個外植體誘導芽密度上，遺傳轉化ipt 的轉基因材料明顯高于空載體材料及對照，其單個外植體平均誘導抗性芽數(shù)為3. 1，顯著高于轉化空載體對照的1. 9個及非轉基因對照材料的2. 0個，進而提高了杜仲胚軸的遺傳轉化效率。結果表明：轉化ipt 基因胚軸轉化效率為2. 95%，明顯高于對照的1. 68%，而未經卡那霉素篩選的非轉基因杜仲胚軸的不定芽誘導率為29. 81%，篩選材料未見不定芽分化。可見ipt 基因對杜仲胚軸遺傳轉化中的不定芽誘導具有促進作用。表2轉植基因對杜仲胚軸不定芽誘導的影響Tab. 2Sho

19、ot inducement ratio of hypocotyls of Eulmoides transformed with Hsp18. 2：flp -35S ：ipt gene轉基因類型外植體分化率/%單個外植體長芽情況平均單個外植體長芽數(shù)不定芽誘導率/%Hsp18. 2：flp 0. 931 51. 91. 68Kan +Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 0. 962 73. 12. 95Kan +對照未篩選15. 201 52. 029. 81對照經篩選00003結論與討論杜仲是遺傳轉化較困難的植物，研究組已獲得農桿菌介導的杜仲遺傳轉化專利授權，但轉化效率不高。本研究利用

20、ipt 基因遺傳轉化杜仲獲得轉基因杜仲芽，首次證明ipt 基因能夠提高轉化困難植物杜仲的遺傳轉化效率，這與之前報道的在煙草、矮牽牛等植物中的研究結果一致4-7。因此ipt 基因可用于杜仲的遺傳轉化，提高遺傳轉化效率。在遺傳轉化外植體的選擇上，杜仲胚軸或子葉均可作為外植體誘導不定芽再生，但誘導率胚軸高于子葉8，因此在本研究中采用胚軸為外植體進行杜仲遺傳轉化計算轉化效率。雖然ipt 基因能夠促進植物遺傳轉化中的不定芽誘導，但其表達可增加轉基因植物細胞內細胞分裂素含量，引起植物的非正常變化7，9-10。研究采用基因構建中包含熱激啟動子驅動重組酶基因flp 的基因刪除表達元件，可在ipt 基因發(fā)生作用后通過熱激處理將其刪除，避免對植物生長發(fā)育帶來的負面影響。目前，杜仲基因刪除工作正在進行中。參考文獻1趙丹，趙德剛，李巖EuFPS 基因表達載體構建及對杜仲遺傳轉化的研究J . 廣西農業(yè)生物科學，2009，28（1）：2