多層軟骨組織工程支架的制備

1、26卷 4期 2007年 8月中 國 生 物 醫(yī) 學(xué) 工 程 學(xué) 報(bào)Chinese Journal o f Biomedical Engineering V ol. 26 N o. 4August 2007收稿日期 :2005212205, 修回日期 :2007205222。基金項(xiàng)目 :國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (50403023 , 廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (4205786 。 3通訊作者。 E 2mail :im wugang . cn多層軟骨組織工程支架的制備吳 剛 3 王迎軍 陳曉峰 葉建東 寧成云 趙娜如 任 力(華南理工大學(xué)特種功能材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 , 廣州

2、 510640摘 要 :軟骨組織工程為關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療提供了一種理想的治療途徑 , 但體外構(gòu)建的軟骨如何在臨床應(yīng)用時(shí) 采用適當(dāng)?shù)姆椒ǘ唐趦?nèi)在體內(nèi)進(jìn)行良好地固定仍然沒有得到很好的解決 , 阻礙了采用組織工程方法治療關(guān)節(jié)軟骨 疾病的臨床應(yīng)用 。 本研究通過冷凍干燥的方法制備出一個(gè)上層為膠原 , 一體化軟骨組織工程支架 , , 到對(duì)上層軟骨進(jìn)行固定的目的 。 架內(nèi)部的分布 ;SE M 程支架 , , , 。為軟骨組織工 關(guān)鍵詞 :; 支架 ; 固定F abrication of Layered Scaffold for C artilage Tissue E ngineeringW U G ang

3、 3 W ANG Y ing 2Jun CHE N X iao 2Feng YE Jian 2D ong NING Cheng 2Y un ZH AO Na 2Ru RE N Li(K ey Laboratory o f Specially Functional Materials , Ministry o f Education , South China Univer sity o f Technology , Guangzhou 510640Abstract :Cartilage tissue engineering is a prom ising therapy for articul

4、ar cartilage lesions. But the problem how to quickly fix the constructed cartilage tissue in vitro to the natural tissue is still under research. This w ould in fluence the w ide application of cartilage tissue engineering production in clinical practice. In this study , a layered articular cartilag

5、e tissue engineering scaffold was made by the freeze 2dry method. The upm ost layer is a pure collagen layer and the downm ost layer is a collagen hydroxyapatite (H A com posite layer. Between the tw o layers are the layers that the H A contents increased. This structure w ith the H A contents has t

6、he osteoconduction capacity , and makes it possible to achieve the fast fixation function of the engineered cartilage through the interaction between the bone and the H A contents in the scaffold once the scaffold im planted into the tissue. The fabrication method and the structure properties of the

7、 layered scaffold were discussed in this paper. The results showed that the pore size and porosity of the collagen layer could be controlled by the frozen tem perature and the collagen solution concentration. The H A particle size and distribution of it w ould in fluence H A s distribution in the co

8、llagen scaffold. SE M pictures showed that the fabricated layered collagen H A com posite scaffold was a 6cm cylinder w ith three different H A content containing layers. Each layer had a height about 2cm. The three layers formed a hom ogeneous unit w ithout any separation between each layer. The la

9、yered scaffold could be a prom ising candidate for the cartilage tissue engineering. K ey w ords :tissueengineering cartilage ; scaffold ; anchoring中圖分類號(hào) R318108 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 025828021(2007 0420612206引言關(guān)節(jié)軟骨損傷是骨科臨床的常見疾病 。 臨床對(duì) 關(guān)節(jié)軟骨損傷治療的手段不多 , 效果也不太理想 1。 目前對(duì)損傷關(guān)節(jié)軟骨的治療方法主要有兩類 :刺激 關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)和組織細(xì)胞移植 2-4。這些方法

10、 能減輕癥狀 , 改善關(guān)節(jié)功能 , 而且能形成透明樣軟骨 修復(fù)組織 , 但形成的透明樣軟骨不是正常關(guān)節(jié)軟骨 , 其功能及耐用性缺乏長期效果觀察 。組織工程化軟骨為病損軟骨組織治療提供了一 種新的途徑 5-7。 但體外培養(yǎng)軟骨在體內(nèi)的固定是 一個(gè)需要解決的重要問題 。 采用手術(shù)固定移植物的 方法 , 操作困難 , 耗時(shí)長 , , 關(guān)節(jié)面光滑 , , 。, 容易導(dǎo)致 受損傷部位組織細(xì)胞死亡 。 采用生物粘合劑由于生 物制品容易感染或傳染各種疾病并受來源的限制 , 且其粘合強(qiáng)度也難以令人滿意 8。目前有一些通過采用組織工程支架的方式來對(duì) 軟骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行體內(nèi)固定的研究報(bào)道 。 如在支架上層 部分構(gòu)建軟骨

11、組織 , 再植入體內(nèi) , 利用支架下層同骨 組織的結(jié)合 , 解決軟骨的體內(nèi)固定的問題 9。這種 支架往往單獨(dú)采用高分子 , 或采用鈣磷鹽材料 , 由于 軟骨和骨對(duì)生長環(huán)境的不同特點(diǎn) , 單一支架難以同 時(shí)很好地滿足軟骨和成骨細(xì)胞的生長要求 10-12。 采用復(fù)合支架的方式 , 如采用多孔生物陶瓷上吸附 一層天然高分子 , 但吸附上的高分子結(jié)合強(qiáng)度不高 , 過度不連續(xù) , 容易分層 , 影響細(xì)胞的生長遷移及固定 效果 13-15。本研究采用了一體復(fù)合支架結(jié)構(gòu) 。 該支架上層 為生物相容性能良好的膠原層 , 可連續(xù)過渡到采用 以羥基磷灰石為主的下層 , 過渡層完全結(jié)合在一起 形成一個(gè)整體 , 避免

12、了以往支架體系存在物理界面 的缺點(diǎn) 。 膠原是軟骨細(xì)胞理想的支架材料 , 而羥基 磷灰石對(duì)骨細(xì)胞及組織有天然的親和性 , 利于支架 植入體內(nèi)后骨組織快速同支架結(jié)合 , 達(dá)到固定上層 軟骨組織的目的 , 從而在一定程度上解決了軟骨固 定的問題 。 本研究對(duì)實(shí)現(xiàn)這種支架結(jié)構(gòu)的工藝方法 進(jìn)行了初步的探索 , 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明通過本研究中采 用的方法能夠制備出具有這種結(jié)構(gòu)特征的支架 。1 材料和方法111 材料 型膠原溶液 (廣州市創(chuàng)爾生物技術(shù)有限公司 , 濃度 6mg m L ,Ca (NO32和 (NH 4 2HPO 4(分析純 , 天 津化學(xué)試劑廠 ,12乙基 232(32二甲基氨丙基 碳二亞 氨

13、(E DC ,10%水溶液 , 吉爾生化有限公司 。112 方法11211 羥基磷灰石 (H A 合成主要步驟為在室溫和 pH =111512的條件下 ,將 (NH42HPO 4溶液滴加到 Ca (NO 3 2溶液中 , 常溫 反應(yīng) 24h , 沉淀 24h 后再用去離子水反復(fù)沉淀物至中 性 , 干燥 、 研磨 、 過篩 、 1100 16。 1121, 最上層為純膠原溶 液 。 放入 4 冰箱中 24h 后 , 再放入低溫冰箱中冷 凍 1h 脫模 , 冷凍干燥 12h , 得到圓柱型組織工程支 架 。11213 測(cè)試方法用 XRD (X pert Pro , PANlytical , Net

14、herland 對(duì)合 成的 H A 粉 末 純 度 進(jìn) 行 分 析 。用 激 光 粒 度 儀 (H oriba , L920, Japan 分析 H A 粉體的粒度分布 。 樣 品用液氮脆斷后 , 斷面噴金 , 在 SE M (Philips X L 230 上觀察材料斷面形貌 。2 結(jié)果與討論211 羥基磷灰石的復(fù)合XRD 圖 (圖 1 測(cè)試結(jié)果證實(shí)了本研究制備的 H A 粉具有較高的純度 , 因此保證其良好的生物活 性 。 H A 的化學(xué)成分與骨組織中無機(jī)礦物的成分相 似 。 有大量的研究表明 H A 生物相容性良好 , 且具 有良好的骨傳導(dǎo)性能 。 H A 是本研究方案中保證支 架底部能

15、夠與骨形成快速結(jié)合的重要因素 。 圖 1中 的膠原與 H A 的比例為 1 1,XRD 圖顯示膠原和 H A 都表現(xiàn)出了各自的特征吸收峰 , 表明復(fù)合工藝對(duì)二 種材料的結(jié)構(gòu)沒有影響 , 保證了二種組分在組織工 程支架中發(fā)揮各自的作用 。212 層狀支架的結(jié)構(gòu)圖 2是采用各 200微升的純膠原 ,1 1和 1 3的 膠原 H A 復(fù)合溶液 , 利用實(shí)驗(yàn)步驟中提到的一體化 支架的制備方法制備出的具有三層結(jié)構(gòu)的膠原 H A 復(fù)合多孔支架 。 圖 2(a 是支架整體的照片 , 從圖中 可以看出一體化支架各層之間緊密的結(jié)合在一起 , 沒有界面存在 , 支架直徑約為 6mm , 高度約為 6mm , 各層

16、的高度約為 2mm 。 圖 2(b 是圖 2(a 中不同 H A 3164期 吳剛等 :多層軟骨組織工程支架的制備圖 1 H A 粉 、 膠原以及膠原 H A 復(fù)合材料 XR D 圖譜 Fig. 1 XR D p atterns of H A , collagen and collagen H A 含量層間的過渡部分的放大 , 從 SE M 中可以明顯看 出 H A c 2(a 過渡 , SE M 2a 、 (b 、 (c , 在支架的成分 上存在一個(gè) H A 含量遞增的結(jié)構(gòu) , 但在支架的空間 物理結(jié)構(gòu)上不存在類似粘合或疊加的這樣一個(gè)過渡 結(jié)構(gòu) , 從而避免了以往由于存在自然界面導(dǎo)致的軟 骨

17、與軟骨下骨結(jié)合難的問題 。由于支架從膠原層到復(fù)合 H A 的復(fù)合結(jié)構(gòu)層形 成了整體的結(jié)構(gòu) , 在保證膠原層上關(guān)節(jié)軟骨良好生 長環(huán)境構(gòu)建的同時(shí) , 做到了支架下部能夠快速地與 周圍骨組織結(jié)合 , 起到固定上部軟骨的目的 。同時(shí) 支架下部的結(jié)構(gòu)能使促進(jìn)軟骨下骨在支架上的生長 增殖 , 促進(jìn)軟骨下骨的生長 , 從而從整體上保證了關(guān) 節(jié)軟骨能夠在一個(gè)理想的生理及力學(xué)環(huán)境中進(jìn)行增 殖 、 分化 , 從而更好地促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的生長 。本研究中所采用的制備方法能夠通過對(duì)不同結(jié) 構(gòu)層的加入比例的調(diào)控調(diào)節(jié)各層的厚度 , 并且能夠 通過在各層溶液中加入各種成分 , 如具有緩釋功能 的微球 , 對(duì)各層的成分進(jìn)行良好的

18、控制 , 以達(dá)到制備 理想軟骨層狀組織工程支架的目的 。213 膠原層結(jié)構(gòu)圖 3是采用不同預(yù)處理溫度及不同膠原溶液濃 度制備的復(fù)合支架上的純膠原層結(jié)構(gòu)的 SE M 照片 , 從中可以看出的膠原支架具有較高的孔隙連通率 , 這種結(jié)構(gòu)利于在組織培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的物質(zhì)代謝 , 同時(shí) 利于在植入體內(nèi)后血管快速長入支架內(nèi)部 , 避免植 入后初期僅通過簡單的物質(zhì)擴(kuò)散而導(dǎo)致的細(xì)胞代謝 時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足造成細(xì)胞死亡 , 導(dǎo)致植入失敗 。 從圖中也可以看出隨預(yù)處理溫度的升高及膠原濃度 的降低支架的孔徑隨之變大 , 支架的孔結(jié)構(gòu)是可以 通過工藝參數(shù)的控制來進(jìn)行調(diào)控的 。圖 2 層狀膠原 H A 復(fù)合支架的 SEM 照

19、片 。 (a 支架整 體結(jié)構(gòu) ;(b 不同 H A 含量層的過渡 ;(c 純膠原向含 H A 部分層的過渡Fig. 2 SEM of layered Collagen H A scaffold. (a bulk structure of the scaffold; (b connection zone of different H A content layer ; (c connection zone of pure collagen layer and collagen H A layer膠原材料由于其特殊的理化性質(zhì) , 往往只能采 用冷凍干燥的成型方法來制備多孔材料 , 支架的孔 隙是通

20、過低溫時(shí)溶劑冰晶升華后留下的空穴形成 , 低濃度及高預(yù)冷凍溫度均可使冰晶更大 。 因此可以 通過對(duì)相關(guān)溫度 、 時(shí)間以及濃度的控制 , 制得需要孔416中 國 生 物 醫(yī) 學(xué) 工 程 學(xué) 報(bào) 26卷 圖 3 膠原三維支架 SEM 照片 (制備條件 :(a -25 , 6mg m L ;(b -85 ,6mg m L ; (c -85 ,1mg m LFig. 3 SEM of pure collagen layer(fabrication condition : (a -25 , 6mg m L ; (b -85 , 6mg m L ; (c -85 , 1mg m L徑的三維支架 , 以滿足

21、臨床應(yīng)用的要求 。使用濃度和粘度低的膠原溶液較利于 H A 在其 中的分散 , 但濃度降低后在制備相同體積的支架材 料時(shí)可導(dǎo)致成型性能下降 。 在對(duì) H A 的分散性能及 膠原支架的成型性能的兼顧上 , 本研究采用了 6mg m L 的膠原溶液 。214 HA 在膠原中的復(fù)合分布結(jié)構(gòu)H A 的粒度大小及分布對(duì)其在膠原中的分散影 響較大 , 細(xì)顆粒不易分散 , 且不同粒徑的顆粒在膠原 支架中的分散方式有所不同 (圖 5(a , H A 的粒度 越小 , 其比表面積越大 , 能夠提供更多的接觸面積 , 提高生物活性 , 但粒度太小容易團(tuán)聚 。而顆粒較大 的 H A 顆粒能夠填充在支架的孔隙內(nèi) ,

22、起到支撐膠 原支架的目的 , 在一定程度上提高了膠原 H A 復(fù)合 支架的力學(xué)強(qiáng)度 。同樣 , H A 的粒度大小及分布對(duì) H A 的降解性能 、 生物學(xué)性能也有重要的影響 , 應(yīng)綜 合考慮 H A 的粒度大小 、 , 促進(jìn)軟骨, , 避免 A , 影響軟骨下骨的再生建 。 本研究采用的 H A 的粒度經(jīng)激光粒度儀的測(cè)試 表明在 013200m 之間 , 平均粒徑約為 38m (圖 4 。圖 4 H A 粉體粒度分布圖Fig. 4 P article distribution of H A powders圖 5是采用 6g L 的膠原濃度為基礎(chǔ)復(fù)合不同 比例的 H A , 采用 -60 進(jìn)行預(yù)

23、冷凍 , 再通過冷凍干 燥的方法成型制備出的 H A 在膠原支架中分散的 SE M 照片 。 圖 5(a 是膠原與 H A 復(fù)合比例為 1:1時(shí) 的 SE M 照片 , 從圖中可以看到膠原仍然保持多孔支 架的結(jié)構(gòu) , 未團(tuán)聚的 H A 小顆粒分布在膠原基質(zhì)形 成的孔壁上 , 部分團(tuán)聚的 H A 填充了膠原支架的孔 隙 , 大顆粒的 H A 粉體直接填充在支架的孔隙內(nèi)部 。 圖 5(b 顯示膠原與 H A 復(fù)合比例為 1 3時(shí) , 膠原仍 然可以形成連續(xù)性支架 , 但 H A 大量填充了膠原支 架的孔隙 , 嚴(yán)重影響了復(fù)合支架的多孔結(jié)構(gòu)的形成 。 圖 5(c 是膠原與 H A 復(fù)合比例為 1 6

24、時(shí)的復(fù)合支架 的 SE M 照片 , 此時(shí)幾乎難以形成多孔的支架結(jié)構(gòu) , 復(fù)合支架以 H A 為主體 , H A 粉體形成堆積的結(jié)構(gòu) , 膠原散在分布在 H A 之間 , 起到類似對(duì) H A 進(jìn)行粘結(jié) 的效果 。5164期 吳剛等 :多層軟骨組織工程支架的制備 圖 5 羥基磷灰石在膠原中分散的 SEM 照片 (膠原與 H A 比例 :(a 1 1;(b 1 3;(c 1 6Fig. 5 SEM of H A distributed in different layer (ratio of collagen and H A :(a 1 1;(b 1 3;(c 1 6H A 在支架內(nèi)的分布特性對(duì)多孔材料的力學(xué)性 能有影響 , 團(tuán)聚以及大顆粒的 H A 粉體通過填充孔 隙起到對(duì)支架的增強(qiáng)作用 。粉體的用量 、 粒度及其 分布也會(huì)對(duì)材料的力學(xué)性能產(chǎn)生不同的影響 , 選擇 適當(dāng)?shù)?H A 的粒度分布及含量能夠在一定