病毒血凝和血凝抑制試驗以新城疫為例

1、實踐二病毒血凝和血凝抑制試驗-（以新城疫為例）實踐目的：1 掌握血凝（HA和血凝抑制（HI）試驗的原理2.掌握雞新城疫病毒血凝和血凝抑制試驗的操作方法實踐原理：某些病毒（如雞新城疫病毒，禽流感病毒等）能夠與人或動物的紅細胞發(fā)生凝集，此即 為紅細胞凝集現(xiàn)象。這種紅細胞凝集現(xiàn)象可于病毒懸液中加入特異性抗體（免疫血清）所 抑制，即為紅細胞凝集抑制試驗。實踐內(nèi)容：1. 紅細胞凝集試驗（HA試驗）主要是測定病毒的紅細胞凝集價，以確定紅細胞凝集抑制 試驗所用病毒稀釋倍數(shù)（抗原單位）。有試管法和微量法兩種，現(xiàn)以常用的微量法進行說明。雞新城疫病毒的HA試驗現(xiàn)采用微量法，在 V形微量反應(yīng)板上進行。（1）首先用微

2、量移液器向每個孔加入稀釋液即滅菌生理鹽水一滴（25卩I）。（2）用微量移液器取病毒抗原液25卩I加入第1孔內(nèi)，吸頭浸于液體中緩慢吸吹幾次使 病毒與稀釋液混合均勻，再吸取 25卩I液體小心地移至第2孔，如此連續(xù)稀釋至第11孔, 第11孔吸取25卩I液體棄掉；病毒稀釋倍數(shù)依為1:21:2048，第12孔為紅細胞對照。（3）再以微量移液器每孔加1.0 %紅細胞懸浮液1滴（25卩I） o（4）在振蕩器上振蕩混勻約I2分鐘，再置37C作用15分鐘后觀察結(jié)果。（5）每次測定樣品都應(yīng)同時做紅細胞對照。表1雞新城疫血凝效價（HA）的測定術(shù)式（微量法）孔號 123456789101112病毒稀釋1:21:41:

3、81:11:31:61:11:21:51:11:2對倍數(shù)624285612024048照生理鹽水卩I病毒液252525252525252525252525卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I棄去1 %紅細胞252525252525252525252525懸液卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I卩I感作置振蕩器上混勻12分鐘，放37C靜置15分鐘結(jié)果例示#+-#表示100%完全凝集+表示50%凝集-表示不凝集結(jié)果判定：將反應(yīng)板傾斜成45度角，沉于管底的紅細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者沉淀， 表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜 后紅細

4、胞不流動，說明紅細胞被病毒所凝集。能使100%紅細胞凝集的病毒液的最高稀釋倍數(shù)，稱為該病毒液的紅細胞凝集效價。如上例：病毒液的HA效價為1:128，HI試驗時，病毒抗原液25微升內(nèi)須含4個凝集單位, 則應(yīng)將原病毒液作成128/4 = 32倍的稀釋液。2. 紅細胞凝集抑制試驗（HI試驗）有試管法和微量法兩種，現(xiàn)以常用的微量法進行說明(1) 用微量移液器每孔各加入1滴稀釋液(即25卩I)，從第1孔到第10孔。第11孔加 稀釋液2滴(50卩I) o(2) 以微量移液器取被檢血清 25卩I，放入第1孔，吸頭浸于液體中緩慢吸吹幾次使 被檢血清與稀釋液混合均勻，再吸取 25卩I液體小心地移至第2孔，如此連

5、續(xù)稀釋至第10 孔，最后第十孔吸取25卩I液體棄掉；被檢血清稀釋倍數(shù)依為1:21:1024，第11孔為紅 細胞對照，第十二孔為抗原對照。(3) 每孔再加入含有四個單位的病毒液1滴(25卩I)至第10孑L,第1I孔為紅細胞對照孔，不加病毒液；第十二孔為抗原對照，加病毒液。(4) 置振蕩器上振蕩I2分鐘后，放37 C靜置20分鐘。(5) 每孔再加入1.0 %紅細胞懸浮液1滴(25卩I)放振蕩器上振蕩I2分鐘混勻，置 37C, 15分鐘后判定結(jié)果。表2雞新城疫紅細胞凝集抑制(H1)試驗(微量法)孔號1 23456789101112被檢血清1:21:41:81:11:31:61:11:21:51:1紅

6、細抗稀釋倍數(shù)624285612024胞原對照對昭八、u Iu Iu Iu Iu Iu Iu Iu Iu Iu Iu Iu被檢血清 2525252525252525252525卩Iu Iu Iu Iu Iu Iu Iu Iu Iu Iu I4單位病 2525252525252525252525毒液卩l(xiāng) 卩l(xiāng)卩l(xiāng) 卩l(xiāng)卩l(xiāng) 卩l(xiāng) 卩l(xiāng) 卩l(xiāng)卩l(xiāng)卩l(xiāng)11振蕩器上振蕩12分鐘，放37 T作用20分鐘1%紅細胞252525252525252525252525懸液卩l(xiāng) 卩l(xiāng) 卩l(xiāng)卩l(xiāng) 卩l(xiāng)卩l(xiāng) 卩l(xiāng) 卩l(xiāng) 卩l(xiāng)卩l(xiāng)卩l(xiāng)11振蕩器上振蕩12分鐘，放137C作用15分鐘結(jié)果例示- - + #-#注：- 表示不

7、凝集、+表示部分凝集、#表示完全凝集 。結(jié)果判定：將反應(yīng)板傾斜成45度角，沉于管底的細細胞沿著傾斜面向下呈線狀流動者為沉 淀，表明紅細胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細胞鋪平孔底，凝成均勻薄層， 傾斜后紅細胞不流動，說明紅細胞被病毒所凝集。能將4單位病毒物質(zhì)凝集紅細胞的作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的紅細胞凝集抑制效價，用被檢血清的稀釋倍數(shù)或以2為底的對數(shù)(10g2)表示。如上例，該血清的紅細胞凝集抑制效價為1： 128或HI效價為7(10g2)。結(jié)果分析：(1) 一般認為雞的免疫臨界水平為1:8(成年)或1:16(雛雞)，隨地區(qū)不同而稍有差異。(2) 雞血清HI抗體效價高于

8、1:16時可適當推遲新城疫免疫的時間，HI抗體效價在1:16以下，須進行新城疫疫苗接疫種，在新城疫流行的地區(qū)或雞場，雞的免疫臨界水平應(yīng)稍提（3）雞群的HI抗體水平是以抽檢樣品的HI抗體效價（炯2）的平均值表示的如果某雞群的10份樣品中，HI抗體效價（炯2）為8的有3份樣品，為7的有5份樣品， 為 6的有 2份樣品，它們的平均值為：8 X 3+ 7X 5+ 6X 2/3 + 5 + 2 = 7.1平均水平在4（10g2）以上，說明該雞群為免疫雞群。 若在檢樣中 HI 抗體效價的最高值與最低值相差太大時， 則不能用上法計算平均水平， 應(yīng)根 據(jù)臨界水平以下的樣品數(shù)在全部樣品中所占的百分比決定免疫與否

9、。（4）大型養(yǎng)雞場，每次進行抽測時，抽樣率一般不低于 0.1 一 0.5，小型雞群，抽 樣率應(yīng)有所增加，一般認為理想的抽樣率應(yīng)為 2.0。（5）雞群接種新城疫疫苗后，經(jīng)23周測血清中的HI抗體效價，若提高2個滴度以上， 表示雞的免疫應(yīng)答良好，疫苗接種成功；若 HI 抗體效價無明顯提高，表示免疫失敗。作業(yè)：1每三位學(xué)生做一個血凝試驗，測定出新城疫病毒的血凝效價，記錄試驗結(jié)果。2根據(jù)血凝價將新城疫病毒稀釋成 4 個單位病毒液， 每三位學(xué)生做一個血凝抑制試驗， 檢測待檢血清的血凝抑制效價，記錄試驗結(jié)果3回答問題：（1）病毒的血凝和血凝抑制試驗的原理是什么？（2）病毒血凝反應(yīng)是抗原抗體反應(yīng)嗎，為什么？

10、（3）病毒血凝抑制反應(yīng)是抗原抗體反應(yīng)嗎，為什么？實踐三 病毒血凝和血凝抑制試驗 - （以新城疫為例）（一）實踐目的：1、掌握血凝及血凝抑制試驗的基本方法及原理2、掌握雞新城疫的試驗室診斷技術(shù)。（二）實踐內(nèi)容與基本要求：實踐原理：某些病毒，如雞新城疫、禽減蛋綜合癥等，有能凝集動物紅細胞的特性，此 即紅細胞凝集現(xiàn)象。這些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能與動物的紅細胞表面的糖蛋白受 體結(jié)合，發(fā)生紅細胞凝集現(xiàn)象?？梢岳眠@一特性判斷被檢材料中有無病毒的存在，并可 以測定病毒的效價。1、 血凝試驗：常多用感染雞胚液進行，凝集價可達 1:160-1:640 也可采用急性病例的 組織浸出液，但凝集價較低。本病毒

11、可凝集許多動物的紅細胞，但凝集性能不夠穩(wěn)定，故 通常作血凝試驗時都采用雞的紅細胞采血部位為心臟或翅靜脈， 取血后加抗凝劑或脫纖維， 置于離心機中搖轉(zhuǎn)加生理鹽水洗滌三次后，將濃縮的紅細胞配成 1%生理鹽水懸液，即可應(yīng) 用。 操作方法見實習(xí)指導(dǎo)。凡能使雞紅細胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)，稱為該病毒的血凝滴度。2、 血凝抑制試驗：單純地使用血凝試驗還不能作出明確的診斷，因為還有其它病原也能 引起紅細胞凝集，如引起慢性呼吸道病的禽敗血支原體。所以需用已知的抗血清作血凝抑 制試驗，以鑒別病毒。也可用已知病毒來測定病雞血清中的抗體，而得明確的診斷。但不 適于急性病例，通常要在感染后的 5-10 天，或出現(xiàn)

12、呼吸癥狀后的 2 天，血清中的抗體到 一定水平，就可用試管法。（三）主要器材與藥品器材： 離心機、試管架、試管、注射器、針頭 5-5.5 號、感染雞胚，微量移液器 1 套， V 型、96 孔板，滴頭，微量振蕩器，塑料采血管，藥品：病毒：雞新城疫弱毒疫苗； 0.85%生理鹽水、 1%紅細胞渾懸液、血清、 4單位病毒。標準陽性血清；濃縮抗原； 0.5%紅細胞渾懸液；被檢血清； pH7.07.2 磷酸緩沖鹽稀 釋液；pH7.07.2磷酸緩沖鹽稀釋液： 氯化鈉（GB126 77） 170g;磷酸二氫鉀（GB127 77）13.6g ;氫氧化鈉（GB629-77） 3.0g ;蒸餾水1000ml;高壓滅

13、菌，4保存，使用是作20倍 稀釋。雞 1%紅細胞懸浮液： 由健康來航公雞羽根靜脈采血迅速置于裝有抗凝血劑（ 3%檸檬酸鈉溶 液）的離心管中，用生理鹽水洗滌 3次，每次以 3000r/min 離心 10分鐘，將血漿、白細胞 等充分洗去，根據(jù)沉淀的紅細胞壓積，用 PH=7的生理鹽水稀釋成1%懸浮液。被檢血清： 每群雞隨機采 2030份血樣，分離血清。采血法：先用三棱針刺破翅下靜脈，隨即用塑料管引流血液至68cm長。將管一端燒融封口，待凝固析出血清后以 1000r/min 離心 5 分鐘，剪斷塑料管，將血清倒入一塊塑料 板小孔中，若需較長時間保存，可在離心后將凝血塊一端剪去，滴融化石蠟封口，于0C保

14、存。（四）實踐方法操作方法4.1 微量血凝試驗4.1.1于微量血凝板的每孔中滴加 磷酸緩沖鹽 稀釋液50ul，共滴四排。4.1.2 吸取 1:5 稀釋抗原 滴加于第一列孔， 每孔 50ul ，然后由左至右順序倍比稀釋至第 11列孔，再從第 11 孔各吸取 50ul 棄之。最后一列不加抗原作對照4.1.3 于每孔加入 0.5%紅細胞懸液 50ul 。4.1.4 置微型振蕩器上振蕩 1 分鐘，或手持血凝板繞圓圈混勻。4.1.5 放室溫下（ 1820oC） 3040分鐘，根據(jù)血凝圖象判定結(jié)果。以出現(xiàn)完全凝集的抗原 最大稀釋度為該 抗原的血凝滴度 。每次四排重復(fù)，以幾何平均值表示結(jié)果。4.1.6計算出

15、含4個血凝單位的抗原濃度，按式（B1）進行計算?？乖瓚?yīng)稀釋倍數(shù)=血凝滴度/4 .（B1）上述材料全部按順序加完后，振蕩 96孔板，使紅細胞與病毒充分接觸，然后置于 20-22 C 室溫中靜置，自第 15分鐘開始觀察結(jié)果，每 5分鐘檢查一次，至 60分鐘結(jié)束，觀察結(jié)果 時注意不要搖震 96 孔板。如果被檢材料中有病毒的存在， 就會出現(xiàn)紅細胞的凝集現(xiàn)象， 紅細胞出現(xiàn)凝集反應(yīng)者 , 凝集成片或碎片 ,呈傘狀鋪于管底 ,不凝集的紅細胞沉積于管底 ,呈一小圓點 ,將板傾斜 ,可 以看到沉積于底板上的紅細胞沿傾斜面呈線狀流動 .（五）結(jié)果觀察：1 首先觀察對照孔，紅細胞應(yīng)無凝集。2觀察實驗孔+全部紅細胞凝

16、集，凝集的紅細胞鋪滿管底，邊緣不整齊，無紅細胞沉積。+ 大部分紅細胞凝集，在管底鋪成薄膜狀，但尚有少數(shù)紅細胞不凝，在管底中心形成小紅點+ 約有半數(shù)紅細胞凝集，在管底鋪成薄膜，面積較小，不凝集的紅細胞在管底中心聚成小 圓點。+只有少數(shù)紅細胞凝集， 不凝集的紅細胞在管底中心聚成小圓盤狀， 凝集的紅細胞在此小圓 盤周圍。- 不凝集，紅細胞沉于管底，成一致密圓盤，邊緣整齊。病毒血凝呈現(xiàn)的不同程度凝集強度凝集效價：能使紅細胞呈 +凝集的病毒最高稀釋度為凝集效價， 表示含有一個單位血凝抗 原。如上述第7孔為+,則該病毒懸液效價為1: 128,即病毒稀釋到1: 128時，每50卩I 中含一個血凝單位的病毒

17、。凝集孔數(shù)越高 , 病毒凝集效價越高 .4單位病毒：血凝試驗（HA測出病毒的HA價，配制成4單位病毒，裝于疫苗瓶中冷凍備 用。病毒的血凝實驗（HA結(jié)果分析（五）雞新城疫微量血凝抑制試驗5.2.1 先取稀釋液 50uI ，加入微量血凝板的第一孔，再取濃度為 4個血凝單位的抗原依次 加入312孔，每孔50uI，第二孔加濃度為8個血凝單位的抗原50uI。5.2.2 吸被檢血清 50uI 于第 1 孔（血清對照）中,擠壓混勻后吸 50uI 于第 2孔,依次倍比稀 釋至1 2孔,最后棄去 50 uI.5.2.3置室溫（18 20C ）下作用20分鐘.5.2.4 滴加 50ul 0.5%紅細胞懸液于各孔中 , 振蕩混合后 , 室溫下靜置 30 40分鐘, 判定結(jié)果5.2.5 每次測定應(yīng)設(shè)已知滴度的 標準陽性血清對照 .結(jié)果判定1 在對照出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下 , 以完全抑制紅細胞凝集的最大稀釋度為該血清的血凝抑制 滴度.2 若有 10%以上的雞出現(xiàn) 11(log 2)以上的高血凝抑制滴度 , 說明雞群已受新城疫強毒感染 .3 若監(jiān)測雞群的免疫水平 ,則血凝抑制滴度在 4(log 2 ) 的雞群保護率為 50%左右;在 4(log 2) 以下的保護率達 90%-100%;在 4(log 2) 以下的 非免疫雞群保護率約為 9%,免疫過的雞群約