Restin基因啟動(dòng)子的克隆及其在HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性

1、    作者：王瑞華，傅海燕，楊國(guó)棟，路凡，趙忠良 【關(guān)鍵詞】  全反式維甲酸    Molecular cloning of restin gene promoter and its transcriptional activities in HeLa cells【Abstract】 AIM: To clone the promoter and construct its luciferase report vector of our newly found gene restin and to analyze

2、its response to the stimulation with alltransretinoic acid (ATRA). METHODS:  Approximate 2000 bp up from the ATG of gene restin was bioinformatics analyzed with computer. The fragment was generated by polymerase chain reaction and cloned the upstream of luciferase report gene into plasmid

3、pG5luc, replacing the five GAL4 binding sites and adenovirus promoter to generate the plasmid Rpluc. Rpluc was transfected into HeLa cells and luciferase activities were measured with or without the treatment of ATRA at indicated time. RESULTS:  We successfully cloned and identified the pr

4、omoter of the gene restin and constructed its luciferase report plasmid. Obvious response to ATRA was found when transfected into HeLa cells and a high expression of luciferase was detected when induced with ATRA. CONCLUSION:  The luciferase report system of restin gene promoter we have co

5、nstructed can be applied for further study of the function and transcriptional regulation of restin.【Keywords】 restin；transcription regulation；promoter；alltransretinoic acid【摘要】 目的：擴(kuò)增細(xì)胞靜息因子(restin)基因啟動(dòng)子并構(gòu)建該啟動(dòng)子的熒光報(bào)告系統(tǒng)，探討其對(duì)全反式維甲酸(alltrans retinoic acid, ATRA)刺激的反應(yīng). 方法：對(duì)restin基因上游約2000 bp基因組序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)生物信息

6、學(xué)分析. 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增restin基因上游序列，將其克隆入pG5luc中，插入熒光素酶報(bào)告基因上游，取代5個(gè)GAL4結(jié)合位點(diǎn)及腺病毒啟動(dòng)子，構(gòu)建Rpluc質(zhì)粒. 將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，ATRA誘導(dǎo)檢測(cè)該質(zhì)粒中熒光素酶的表達(dá). 結(jié)果：酶切及測(cè)序結(jié)果均證實(shí)成功克隆了restin基因上游序列，已將該序列插入到熒光素酶基因的上游；ATRA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞中的真核表達(dá)載體Rpluc，熒光素酶表達(dá)明顯增加. 結(jié)論：成功構(gòu)建了含有restin基因啟動(dòng)子序列的熒光報(bào)告系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究restin基因功能及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定了基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】 restin；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；啟動(dòng)子；全反式維甲酸0引言

7、細(xì)胞靜息因子(restin)基因是在全反式維甲酸（alltrans retinoic acid, ATRA）誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞中差異表達(dá)的基因之一（Genbank登錄號(hào):  NM_014061），屬于黑色素瘤相關(guān)抗原（melanoma associated antigen，MAGE）家族，將其導(dǎo)入白血病細(xì)胞可以抑制細(xì)胞增殖1-2. 路凡等3認(rèn)為可以將MAGE家族分為酸性MAGE蛋白和堿性MAGE蛋白. 有意義的是堿性MAGE蛋白在終末分化細(xì)胞和生殖細(xì)胞中表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，而酸性MAGE蛋白則在終末分化細(xì)胞中不表達(dá)，只表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和生殖細(xì)胞中. 同時(shí)在ATRA

8、誘導(dǎo)的腫瘤分化細(xì)胞中，表現(xiàn)出酸性MAGE蛋白降低和堿性MAGE蛋白升高，restin正好也為堿性MAGE蛋白. 組織表達(dá)譜分析表明restin主要表達(dá)在正常終末分化組織，而在腫瘤組織中不表達(dá)或表達(dá)量極低4. 因此，研究restin的表達(dá)調(diào)控不但可以增強(qiáng)對(duì)restin的作用機(jī)制的理解，同時(shí)也可促進(jìn)對(duì)腫瘤細(xì)胞分化控制機(jī)制的了解. 我們根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果的提示，從胎兒肌肉基因組DNA中擴(kuò)增得到含預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)和調(diào)控元件restin基因翻譯起始位點(diǎn)上游約2000 bp DNA序列，并利用KpnI 酶切位點(diǎn)和NcoI酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增序列導(dǎo)入熒光報(bào)告載體pGL5Luc中，取代5個(gè)GAL4結(jié)合位點(diǎn)及腺病毒啟

9、動(dòng)子，然后將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞中檢測(cè)ATRA誘導(dǎo)前后轉(zhuǎn)錄活性，為研究該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及功能奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料大腸桿菌菌種DH5和HeLa細(xì)胞為第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室保存；限制性內(nèi)切酶、pyrobest酶、pMD18T Vector（寶生物工程公司）；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000及1640培養(yǎng)基（Invitrogen公司）；新生牛血清（杭州四季青公司）；DL2000 marker（華美生物工程公司）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒及產(chǎn)物純化試劑盒超純?nèi)?nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Vgene公司）；E.Z.N.A TM 組織DNA提取試劑盒（Omega公司）；

10、ATRA（美國(guó)Sigma公司）；雙熒光報(bào)告系統(tǒng)及照度計(jì)TD20/20檢測(cè)儀（Promega公司）；寡核苷酸引物合成及測(cè)序由三博生物技術(shù)公司完成.1.2方法1.2.1restin基因5端上游序列的生物信息學(xué)分析利用NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)查找restin基因5端上游序列，使用McPromoter promoter prediction server軟件進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)，Vector NTI分析部分轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(100%匹配).1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成設(shè)計(jì)引物：上游引物引入KpnI酶切位點(diǎn)5ac ggt acc gcc cta cgt ttg aga tta agt cgc3, 下游引物引入NcoI

11、酶切位點(diǎn)5cga gcc atg gct cct gat aga ggc tc3.1.2.3基因組DNA提取提取人胎兒股部肌肉組織基因組DNA，按照試劑盒提供的操作手冊(cè)進(jìn)行操作.1.2.4PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子提取的基因組DNA稀釋10倍后取1 L作為PCR反應(yīng)模板，反應(yīng)體系為：引物400 nmol/L，dNTP 200 mol/L, pyrobest酶1 U; 反應(yīng)參數(shù)為：95 30 s, 58 20 s, 72 120 s, 30個(gè)循環(huán).1.2.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化回收，再用Taq酶1 U，dATP 200 mol/L，72 30 min加入多聚A尾, 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠

12、電泳純化回收后，將片段連入pMD 18T Vector載體（4過夜），轉(zhuǎn)化. 以上過程均參照文獻(xiàn)5進(jìn)行，轉(zhuǎn)化的菌液鋪制在含IPTG和Xgal的Amp抗性的LB瓊脂平板上培養(yǎng)，利用互補(bǔ)原理，通過藍(lán)白斑篩選出重組子. 經(jīng) KpnI 和 NcoI雙酶切鑒定出有插段的陽性克隆及方向. 挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，做測(cè)序反應(yīng).1.2.6熒光報(bào)告質(zhì)粒Rpluc的構(gòu)建KpnI和NcoI雙酶切pG5luc質(zhì)粒的GAL4 結(jié)合區(qū)域，將測(cè)序結(jié)果正確的片段與pG5luc連接，構(gòu)建熒光報(bào)告質(zhì)粒Rpluc.1.2.7熒光報(bào)告系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)含2 mmol/L谷氨酰氨和100 mL/L FBS的1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)HeLa細(xì)

13、胞. 在轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種于24孔板，37, 50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)細(xì)胞至次日80%90%鋪滿時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染. 每孔轉(zhuǎn)入質(zhì)粒Rpluc 0.8 g; pBind 0.01 g. 轉(zhuǎn)染46 h后，換為含1×10-6 mol/L ATRA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以不加ATRA者作陰性對(duì)照.1.2.8熒光素酶的檢測(cè)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后小心吸去孔中的培養(yǎng)基，加入足量的PBS洗滌培養(yǎng)孔，每孔中加入100 L 1×PLB（Passive lysis buffer, 裂解液），室溫?fù)u動(dòng)孵育15 min，充分溶解轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 吸取細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，13 000 g離心

14、5 min, 吸取上清液. 按照雙熒光報(bào)告系統(tǒng)的說明書進(jìn)行操作，分別檢測(cè)得到螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的熒光值，二者的比值即為相對(duì)熒光表達(dá)量，代表啟動(dòng)子的活性. 每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，取平均值.2結(jié)果2.1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的與凋亡和ATRA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)restin基因上游序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)：該序列中含有一個(gè)p53結(jié)合位點(diǎn)aagacaagctt和一個(gè)C/EBP結(jié)合位點(diǎn)ttgcttaa；三個(gè)GAS（STAT）結(jié)合位點(diǎn),依次是ttcctggaaa，ttctcagaat，ttccaagaat. 啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)restin基因上游2000 bp存在三個(gè)可能

15、的啟動(dòng)子區(qū).2.2熒光報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建以提取的基因組DNA為模板，擴(kuò)增出restin基因上游序列，大小為2170 bp,克隆入pG5luc載體，命名Rpluc. 酶切鑒定如圖1所示.2.3熒光報(bào)告系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)ATRA刺激轉(zhuǎn)染熒光報(bào)告質(zhì)粒Rpluc的Hela細(xì)胞后，熒光素酶活性測(cè)值明顯增加，表明所構(gòu)建的restin基因啟動(dòng)子報(bào)告系統(tǒng)有轉(zhuǎn)錄活性（圖2）.3討論隨著新基因不斷被發(fā)現(xiàn)，目前已知的基因數(shù)量越來越多，在對(duì)新基因結(jié)構(gòu)與功能的研究中，最重要的內(nèi)容之一就是基因的表達(dá)調(diào)控. 闡明基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，不但可以深入了解疾病發(fā)生的原因，而且對(duì)于基因治療的研究也具有十分重要的意義. 啟動(dòng)子區(qū)的克隆是對(duì)基因

16、表達(dá)調(diào)控進(jìn)行研究的必要條件，通過啟動(dòng)子研究，許多新基因功能及其在信號(hào)傳導(dǎo)中的地位漸被認(rèn)識(shí)（如新基因IRS3轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定6，caspase8轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的發(fā)現(xiàn)7及轉(zhuǎn)錄因子p53與FAK基因相互關(guān)系8等）. restin基因是ATRA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化克隆得到的差異表達(dá)基因之一，該基因的表達(dá)特征和表達(dá)水平是如何受到調(diào)控的值得深入研究.克隆新基因的啟動(dòng)子是對(duì)研究基因表達(dá)調(diào)控和構(gòu)建表達(dá)載體至關(guān)重要. 對(duì)于已知基因序列清楚的情況下首先采用的就是PCR法. PCR法的主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快捷、操作簡(jiǎn)單；其缺點(diǎn)是只能擴(kuò)增兩端已知序列間的DNA區(qū)，且擴(kuò)增的特異性較低. 其適用條件是建立在對(duì)基因序列十分清楚的基

17、礎(chǔ)上，只有知道基因的全序列，才可根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出該基因的啟動(dòng)子. 設(shè)計(jì)引物之前，應(yīng)用生物信息學(xué)的方法通過軟件預(yù)測(cè)，對(duì) restin基因翻譯起始位點(diǎn)上游約2000 bp DNA序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中含三個(gè)可能的啟動(dòng)子區(qū)域，以及p53，C/EBP，STAT等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn). ATRA是經(jīng)典的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化劑，restin是通過ATRA分化誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因，我們選擇了熒光報(bào)告載體構(gòu)建了帶有restin基因啟動(dòng)子的熒光報(bào)告質(zhì)粒(Rpluc)，確定該報(bào)告系統(tǒng)在ATRA誘導(dǎo)分化的HeLa細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性，并且可以作為研究restin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要工具；我們的研究結(jié)果證明該構(gòu)建啟

18、動(dòng)子報(bào)告系統(tǒng)的方法是可行的, 為研究其他新基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了一種準(zhǔn)確可靠的熒光報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建方法，并且該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性受ATRA調(diào)控. 為下一步研究不同截短體啟動(dòng)子區(qū)域的活性和確定轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域、深入研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】1 Zhao ZL, Huang X, Li N, et al. Direct cloning of cell differential expression genes with fulllength by a new strategy based on the multiple rounds of "long distance&q

19、uot; PCR and magnetic beads mediated subtraction J. J Biotech, 1999, 73: 35-41.2  Zhu F, Yan W, Zhao ZL, et al. Improved PCRbased subtractive hybridization strategy for cloning differentially expressed genes J. J Biotech, 2000, 29(2): 310-313.3 路凡，楊輝，王孝功，等. 堿性MAGE家族新成員restin在大腸桿菌中的表達(dá)和抗體制備J. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2005, 21(3): 309-311.4  Zhao ZL, Lu F, Zhu F, et al. Cloning and comparative biology study of Restin, a novel member of MAGE superfamily J. Sci China (Series C), 2002, 45(4):412-420.5  Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T(金東雁，黎孟楓譯). 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 M.