支氣管上皮細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞的不同培養(yǎng)方式對IL(一)

1、支氣管上皮細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞的不同培養(yǎng)方式對IL(一)    作者：王成彬，黃振國，葉偉基，李洛誼，鮑依稀，童紅莉，田亞平，林偉基 【關(guān)鍵詞】 支氣管；上皮細(xì)胞；嗜酸細(xì)胞；白細(xì)胞介素【Abstract】 AIM: To investigate the effect of different culture systems on IL6 release in model of coculture of human bronchial epithelial cells and eosinophils. METHODS: Human bronchial epit

2、helial cells and eosinophils were cultured or cocultured in separation, contact and Matrigel system. IL6 release in different culture systems of bronchial epithelial cells and eosinophils was determined by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: Compared with the sum of IL6 in culture sup

3、ernatants of bronchial epithelial cells and eosinophils alone, IL6 release exhibited a synergistic effects in coculture of the two kinds of cells in a well separated into up and down chambers by the screen, that could sustain the culture supernatant across (107±10) ng/L vs (388±40) ng/L, P

4、0.001. But IL6 release in coculture of the two kinds of cells separated using screen was less than that in their contact coculture (388±40) ng/L vs (1270±131) ng/L, P0.001). Coculture of bronchial epithelial cells and eosinophils in Matrigel system led to asignificant elevation of IL6 rele

5、ase compared with that in general contact coculture of the two kinds of cells (2076±165) ng/L vs (1270±131) ng/L, P0.01). CONCLUSION: Human bronchial epithelial cells and eosinophils can be activated to release IL6 by contacting each other and mediators that they released in coculture.【Key

6、words】 bronchi; epithelial cells; eosinophils; interleukin6【摘要】 目的： 以支氣管上皮細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞共培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停接懖煌囵B(yǎng)方式對IL6釋放的影響. 方法： 將支氣管上皮細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞分別單獨(dú)培養(yǎng)、接觸共同培養(yǎng)、分隔共同培養(yǎng)（用分隔膜將兩種細(xì)胞分隔在上、下兩個(gè)池中不接觸培養(yǎng)，兩池中的培養(yǎng)液可以自由通過分隔膜孔）和在Matrigel中共同培養(yǎng). 兩種細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下釋放的IL6應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法定量. 結(jié)果： 支氣管上皮細(xì)皮與嗜酸粒細(xì)胞在同一培養(yǎng)孔中分隔共同培養(yǎng)時(shí)其IL6釋放量遠(yuǎn)高于兩種細(xì)胞分別在兩個(gè)培養(yǎng)孔中獨(dú)自培

7、養(yǎng)后上清液中IL6之和(388±40) ng/L vs (107±10) ng/L, P0.001.而兩種細(xì)胞在同一培養(yǎng)孔中（沒有隔膜分隔）接觸共同培養(yǎng)，其IL6釋放量又遠(yuǎn)高于其分隔培養(yǎng)(1270±131) ng/L vs (388±40) ng/L, P0.001；將上述兩種細(xì)胞在Matrigel中共培養(yǎng),其IL6釋放又顯著高于其在非Matrigel中的培養(yǎng) (2076±165) ng/L vs (1270±131) ng/L, P0.01. 結(jié)論： 支氣管上皮細(xì)胞與嗜酸粒細(xì)胞共同培養(yǎng)過程中可受到相互接觸和其在培養(yǎng)過程中所釋放的某些

8、物質(zhì)的活化，從而增加多功能細(xì)胞因子IL6的釋放.【關(guān)健詞】 支氣管；上皮細(xì)胞；嗜酸細(xì)胞；白細(xì)胞介素6支氣管上皮可通過其黏膜纖毛系統(tǒng)發(fā)揮對外源性物質(zhì)（塵埃、病原微生物等）的屏障功能. 但最近的研究結(jié)果表明，在多種氣道炎性疾病過程中，支氣管上皮細(xì)胞可增加釋放IL6, IL8,腫瘤壞死因子（TNF）等炎性介質(zhì)1-2，這些炎性介質(zhì)對淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞具有活化和趨化作用3-4. 活化后的嗜酸粒細(xì)胞可釋放多種炎性介質(zhì)，因而被認(rèn)為是過敏性炎癥反應(yīng)的主要作用細(xì)胞5. IL6是一種具有多功能作用的細(xì)胞因子，其作為炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)炎癥急性期蛋白的合成并可通過對T輔助淋巴細(xì)胞

9、的活化和分化而介導(dǎo)不同的免疫和炎癥反應(yīng)6. 因此，IL6合成和釋放對氣道炎癥的啟動(dòng)、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸都具有十分重要的作用. 我們用人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS2B細(xì)胞和外周血嗜酸性粒細(xì)胞共培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察兩種細(xì)胞不同培養(yǎng)方式對IL6釋放的影響，探討炎性細(xì)胞從外周血遷移至支氣管上皮產(chǎn)生黏膜炎癥反應(yīng)的機(jī)制.1材料和方法1.1材料支氣管上皮細(xì)胞系BEAS2B細(xì)胞為12SV40腺病毒轉(zhuǎn)染的正常人支氣管上皮細(xì)胞，購于美國ATCC公司；DMEM/F12, RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibco Invitrogen公司；密度1.082 kg/L Percoll溶液: 混合87.92 mL Percol

10、l 原液(密度1.130 kg/L, 瑞典Amersham 公司產(chǎn)品)，15 mL 1.5 mol/L NaCl和 47.1 mL去離子水；抗CD16抗體磁珠和細(xì)胞磁性分離系統(tǒng)（MACS）購自德國Miltenyi Biotec 公司；Matrigel和細(xì)胞轉(zhuǎn)膜插槽（孔徑0.4 m）購于美國BD公司；IL6 ELISA測定試劑盒購于 美國Bio Source公司，新鮮人全血由香港紅十字會輸血服務(wù)中心提供.1.2方法統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次（n=3），數(shù)據(jù)用x±s表示，兩種細(xì)胞在不同培養(yǎng)體系中所釋放IL6量的比較應(yīng)采用方差分析，并用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理. P0.05表示差異有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1嗜酸粒細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞不同方式的共培養(yǎng)BEAS2B細(xì)胞貼壁生長到融合后加入嗜酸粒細(xì)胞與其共培養(yǎng)，嗜酸粒細(xì)胞可均勻分散于BEAS2B表面與之直接接觸（圖1A）. 在BEAS2B細(xì)胞與嗜酸粒細(xì)胞分隔共培養(yǎng)體系中，未見嗜酸粒細(xì)胞從上層細(xì)胞培養(yǎng)池透過插槽隔膜進(jìn)入下層細(xì)胞培養(yǎng)池（圖1B）. 當(dāng)BEAS2B細(xì)胞與嗜酸粒細(xì)胞在Matrigel體系中接觸共培養(yǎng)時(shí)，BEAS2B細(xì)胞單細(xì)胞面與嗜酸粒細(xì)胞接觸數(shù)量增加（圖1C）.2.2嗜酸粒細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞分隔共培養(yǎng)對IL6釋放的影響用分隔膜將嗜酸粒細(xì)胞與BEAS2B細(xì)胞分隔在同一孔中共培養(yǎng)15 h，其共培養(yǎng)上清液中IL6濃度顯著高于

12、兩種細(xì)胞分別單獨(dú)培養(yǎng)之和（388±40） ng/L vs （107±10） ng/L, P0.001.2.3嗜酸粒細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞接觸共培養(yǎng)對IL6釋放的影響嗜酸性粒細(xì)胞和BEAS2B細(xì)胞接觸共培養(yǎng)15 h，其IL6釋放量顯著高于兩種細(xì)胞分隔共培養(yǎng)(1270±131) ng/L vs (388±40)ng/L, P0.001.2.4嗜酸粒細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞在Matrigel中共培養(yǎng)對IL6釋放的影響 嗜酸粒細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞在Matrigel中共培養(yǎng)15 h，培養(yǎng)上清液中IL6濃度又大大高于兩種細(xì)胞接觸共培養(yǎng)（2076±165） ng/

13、L vs (1270±131) ng/L, P0.01.3討論在過敏性哮喘過程中，活化后的大量炎性細(xì)胞特別是嗜酸粒細(xì)胞向氣道炎癥部位遷移，其在氣道上皮釋放的各種炎性介質(zhì)不僅能夠造成支氣管上皮細(xì)胞損傷，介導(dǎo)氣道上皮修復(fù)和氣道重建，還可進(jìn)一步活化和趨化炎性細(xì)胞的遷移，調(diào)控過敏性氣道炎癥反應(yīng)過程3-5. 近年來的大量研究結(jié)果表明，支氣管上皮受到外源微生物、蛋白酶、過敏原蛋白、細(xì)胞因子等刺激后，可釋放多種炎性介質(zhì)7-8，因此其在氣道炎性疾病中可能具有重要的免疫調(diào)控功能，而此種功能的A： 兩種細(xì)胞接觸共培養(yǎng)，左下圖為嗜酸粒細(xì)胞，右上圖為支氣管上皮細(xì)胞×100；B： 兩種細(xì)胞分隔共培養(yǎng)

14、；C： 兩種細(xì)胞在Matrigel體系中共培養(yǎng)，左下圖為嗜酸粒細(xì)胞，右上圖為支氣管上皮細(xì)胞×100.圖1嗜酸粒細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞不同方式的共培養(yǎng)啟動(dòng)除與外源性物質(zhì)刺激有關(guān)外，還可能與炎性細(xì)胞同其接觸及炎性細(xì)胞分泌的炎性介質(zhì)對其活化有關(guān). 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在過敏性炎癥反應(yīng)中具有重要作用的嗜酸粒細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞系BEAS2B細(xì)胞接觸共培養(yǎng),可顯著增加炎性細(xì)胞因子IL6的釋放，這就證明了兩種細(xì)胞在接觸培養(yǎng)過程中可發(fā)生活化作用. 而當(dāng)嗜酸粒細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞在同一培養(yǎng)槽中經(jīng)微孔膜相隔共培養(yǎng)過程中，IL6釋放高于兩種細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng). 在此培養(yǎng)體系中，由于轉(zhuǎn)膜插槽中微孔膜的孔徑小于嗜酸

15、粒細(xì)胞直徑，因而在上層培養(yǎng)池中的嗜酸粒細(xì)胞不能透過微孔膜進(jìn)入下層培養(yǎng)池與BEAS2B細(xì)胞發(fā)生接觸，但微孔膜的孔徑不影響細(xì)胞培養(yǎng)過程中所分泌的細(xì)胞因子等大分子蛋白質(zhì)通過. 本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，兩種細(xì)胞分隔共培養(yǎng)過程中所釋放的介質(zhì)可刺激所培養(yǎng)細(xì)胞釋放IL6. 但在上述實(shí)驗(yàn)中去除分隔膜，使兩種細(xì)胞接觸培養(yǎng)，結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL6濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于兩種細(xì)胞分隔共培養(yǎng)體系. 這就意味著兩種細(xì)胞相互接觸對其活化和細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能更具意義. 上述兩種細(xì)胞在接觸培養(yǎng)過程中由于BEAS2B細(xì)胞是貼壁生長，因而影響其與嗜酸粒細(xì)胞共培養(yǎng)過程中的接觸面積，當(dāng)兩種細(xì)胞在Matrigel體系中共培養(yǎng)時(shí)，由于Matrig

16、el分子間具有一定的空隙，從而使得嗜酸粒細(xì)胞在共培養(yǎng)過程中可以從不同的側(cè)面與BEAS2B細(xì)胞接觸，從而大大提高了兩種細(xì)胞共培養(yǎng)過程中相互活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，結(jié)果導(dǎo)致IL6釋放的增加. 從本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出如下結(jié)論：炎性細(xì)胞從外周血遷移到支氣管上皮與支氣管上皮細(xì)胞接觸，對兩種細(xì)胞之間的相互活化并釋放炎性介質(zhì)調(diào)控氣道炎性反應(yīng)過程具有重要意義，而兩種細(xì)胞活化后釋放的炎性介質(zhì)可進(jìn)一步加強(qiáng)兩種細(xì)胞的活化.【參考文獻(xiàn)】1 Lampinen M, Carlson M, Hakansson LD, et al. Cytokineregulated accumulation of eosinophils

17、in inflammatory disease J. Allergy, 2004,59（8）:793-805.2 Sabatini F, Silvestri M, Sale R, et al. Cytokine release and adhesion molecule expression by stimulated human bronchial epithelial cells are downregulated by salmeterolJ. Respir Med, 2003,97（9）:1052-1060.3 Lukacs NW. Role of chemokines in the

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