顯微鏡成像質(zhì)量

1、1影響顯微鏡成像的關(guān)鍵因素-像差由于客觀條件，任何光學(xué)系統(tǒng)都不能生成理論上理想的像，各種像差的存在影響了成像質(zhì)量。所謂像差（aberration），是指測量顯微鏡或者體視顯微鏡透鏡或反射鏡所呈的像與原 物面貌并非完全相同的現(xiàn)象。像差又可以分為幾類，例如球面像差是由于一點(diǎn)光源發(fā)散的光 線被分聚在不同的點(diǎn)上的緣故。色彩像差的原因是透鏡的折光指數(shù)隨光波的長短而變化，從而引起像的邊緣呈現(xiàn)色彩?？梢岳斫鉃閷?shí)際像與根據(jù)單透鏡理論確定的理想像的偏離，這些偏離是折射定律造成的。像差是由透鏡對色光的不同彎曲能力所致，并造成帶有色暈的像。 與色無關(guān)的像差（“單色像差”）包括使像變形的像差（“畸變”、“場曲”）和使

2、像模糊的像差（“球差”、“彗差”、“散光”）。像差在金相顯微鏡、數(shù)碼CCD、生物顯微鏡和其他光學(xué)顯微鏡中可以通過透鏡的組合減小到最低限度。鏡面也有與透鏡一樣的單色像差，但沒有像差。色差（Chromatic aberration）色差是透鏡成像的一個(gè)嚴(yán)重缺陷，發(fā)生在多色光為光源的情況下，單色光不產(chǎn)生色差。白光由紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫七種組成，各種光的波長不同，所以在通過透鏡時(shí)的折 射率也不同，這樣物方一個(gè)點(diǎn)，在像方則可能形成一個(gè)色斑。色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置觀察都帶有色斑或暈環(huán)，使像模糊不清。而放大率色差使像帶有彩色邊緣。顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)最主要的功能就是消色差。球

3、差（Spherical aberration）球差是軸上點(diǎn)的單色相差，是由于透鏡的球形表面造成的。球差造成的結(jié)果是，一個(gè)點(diǎn)成像后，不在是個(gè)亮點(diǎn)，而是一個(gè)中間亮邊緣逐漸模糊的亮斑，從而影響成像質(zhì)量。球差的矯正常利用透鏡組合來消除，由于凸、凹透鏡的球差是相反的， 可選配不同材料舊型號顯微鏡，物鏡的球差沒有完全矯正， 應(yīng)與相應(yīng)的補(bǔ)償現(xiàn)一般生物顯微鏡、工業(yè)顯微鏡包括體視顯微鏡的球差完全 由物鏡消除。慧差（Coma）慧差屬軸外點(diǎn)的單色像差。 軸外物點(diǎn)以大孔徑光束成像時(shí)，發(fā)出的光束通過透鏡后， 不再相交一點(diǎn)，則一光點(diǎn)的像便會得到一逗點(diǎn)狀，型如慧星，故稱“慧差”。使用軸向平行光可以消除慧差。的凸凹透鏡膠合起

4、來給予消除。目鏡配合，才能達(dá)到糾正效果。2像散(Astigmatism)像散也是影響清晰度的軸外點(diǎn)單色像差。當(dāng)視場很大時(shí)，邊緣上的物點(diǎn)離光軸遠(yuǎn)，光束傾斜大，經(jīng)透鏡后則引起像散。像散使原來的物點(diǎn)在成像后變成兩個(gè)分離并且相互垂直的短 線，在理想像平面上綜合后，形成一個(gè)橢圓形的斑點(diǎn)。像散是通過復(fù)雜的透鏡組合來消除。場曲(Curvature of field)場曲又稱“像場彎曲”。當(dāng)透鏡存在場曲時(shí)，整個(gè)光束的交點(diǎn)不與理想像點(diǎn)重合，雖然在每個(gè)特定點(diǎn)都能得到清晰的像點(diǎn)，但整個(gè)像平面則是一個(gè)曲面。這樣在鏡檢時(shí)不能同時(shí)看清整個(gè)像面，給觀察和照相造成困難。因此研究用顯微鏡的物鏡(包括奧林巴斯顯微鏡、尼 康顯微鏡

5、、蔡司顯微鏡等系列)一般都是平場物鏡，這種物鏡已經(jīng)矯正了場曲?；?Distortion)前面所說各種像差除場曲外，都影響像的清晰度?；兪橇硪环N性質(zhì)的像差，光束的同心性不受到破壞。因此，不影響像的清晰度，但使像與原物體比，在形狀上造成失真。(1)當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時(shí)，則在像方二倍焦距以內(nèi)、焦點(diǎn)以外形成縮小的倒立實(shí)像；(2)當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時(shí)，則在像方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實(shí)像；(3)當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點(diǎn)以外時(shí)，則在像方二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)像；(4)當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)上時(shí)，則像方不能成像；(5)當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)以內(nèi)時(shí)，則像方也無像

6、的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的位置形成 放大的直立虛像。顯微鏡的成像原理就是利用上述（ 3 ）和（5 ）的規(guī)律把物體放大的。當(dāng)物體處在物鏡前 F-2F （F 為物 方焦距）之間，則在物鏡像方的二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)像。在顯微鏡的設(shè)計(jì)上，將此像落在目鏡 的一倍焦距 F1 之內(nèi)，使物鏡所放大的第3一次像（中間像） ，又被目鏡再一次放大，最終在目鏡的物方（中 間像的同側(cè)） 、人眼的明視距離（ 250mm ）處形成放大的直立（相對中間像而言）虛像。因此，當(dāng)我們在 鏡檢時(shí)，通過目鏡（不另加轉(zhuǎn)換棱鏡）看到的像與原物體的像，方向相反。如今的顯微鏡在物鏡設(shè)計(jì)上已經(jīng)逐步設(shè)計(jì)出了平場消色差物鏡、半復(fù)消

7、色差物鏡、甚 至全復(fù)物鏡，對于顯微鏡成像質(zhì)量給了很好的保證影響顯微成像質(zhì)量的因素-顯微鏡鏡頭顯微鏡鏡頭分不同類型，但即使對于同一類型的鏡頭，其成像質(zhì)量也有著很大的差異，這主 要是由于材質(zhì)、加工精度和鏡片結(jié)構(gòu)的不同等因素造成的， 同時(shí)也導(dǎo)致不同檔次的鏡頭價(jià)格 從幾百元到幾萬元的巨大差異。 比較著名的如四片三組式天塞鏡頭、六片四組式雙高斯鏡頭。對于鏡頭設(shè)計(jì)及生產(chǎn)廠家， 一般用光學(xué)傳遞函數(shù)OTF（Optical Transfer Function）來綜合評價(jià) 鏡頭成像質(zhì)量， 光學(xué)系統(tǒng)傳遞的是亮度沿空間分布的信息， 光學(xué)系統(tǒng)在傳遞被攝景物信息時(shí)， 被傳遞之各空間頻率的正弦波信號， 其調(diào)制度和位相在成實(shí)

8、際像時(shí)的變化， 均為空間頻率的 函數(shù)，此函數(shù)稱為光學(xué)傳遞函數(shù)。OTF一般由調(diào)制傳遞函數(shù)MTF（Modulation Transfer Function）與位相傳遞函數(shù)PTF（Phase Transfer Function ）兩部分組成。像差是影響圖像質(zhì)量的 重要方面，常見的像差有如下六種：球差:由主軸上某一物點(diǎn)向光學(xué)系統(tǒng)發(fā)出的單色圓錐形光束， 經(jīng)該光學(xué)系列折射后， 若原光束不同 孔徑角的各光線，不能交于主軸上的同一位置， 以至在主軸上的理想像平面處， 形成一彌散 光斑（俗稱模糊圈），則此光學(xué)系統(tǒng)的成像誤差稱為球差?；鄄?由位于主軸外的某一軸外物點(diǎn)，向光學(xué)系統(tǒng)發(fā)出的單色圓錐形光束，經(jīng)該光學(xué)系列折

9、射后， 若在理想像平面處不能結(jié)成清晰點(diǎn)， 而是結(jié)成拖著明亮尾巴的慧星形光斑， 則此光學(xué)系統(tǒng)的 成像誤差稱為慧差。像散:由位于主軸外的某一軸外物點(diǎn)， 向光學(xué)系統(tǒng)發(fā)出的斜射單色圓錐形光束， 經(jīng)該光學(xué)系列折射 后，不能結(jié)成一個(gè)清晰像點(diǎn)，而只能結(jié)成一彌散光斑，則此光學(xué)系統(tǒng)的成像誤差稱為像散。 場曲:垂直于主軸的平面物體經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)所結(jié)成的清晰影像， 若不在一垂直于主軸的像平面內(nèi)， 而 在一以主軸為對稱的彎曲表面上， 即最佳像面為一曲面， 則此光學(xué)系統(tǒng)的成像誤差稱為場曲。 當(dāng)調(diào)焦至畫面中央處的影像清晰時(shí)，畫面四周的影像模糊;而當(dāng)調(diào)焦至畫面四周處的影像清晰時(shí)，畫面中央處的影像又開始模糊。色差:由白色物體向光

10、學(xué)系統(tǒng)發(fā)出一束白光，經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)折射后，各色光不能會聚于一點(diǎn)上，而形 成一彩色像斑，稱為色差。色差產(chǎn)生的原因是同一光學(xué)玻璃對不同波長的光線的折射率不同，短波光折射率大，長波光折射率小。畸變：被攝物平面內(nèi)的主軸外直線， 經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)成像后變?yōu)榍€， 則此光學(xué)系統(tǒng)的成像誤差稱為畸 變。畸變像差只影響影像的幾何形狀，而不影響影像的清晰度。這是畸變與球差、慧差、像 散、場曲之間的根本區(qū)別。我們在評價(jià)鏡頭質(zhì)量時(shí)一般還會從分辨率、明銳度和景深等幾個(gè)實(shí)用參數(shù)判斷。 分辨率：又稱鑒別率、 解像力， 指鏡頭清晰分辨被攝景物纖維細(xì)節(jié)的能力， 制約鏡頭分辨率的原因是 光的衍射現(xiàn)象，即衍射光斑（愛里斑）。分辨率的單位是線

11、對/毫米。明銳度（Acutance）： 也稱對比度，是指圖像中最亮和最暗的部分的對比度。 景深（DOF）：在景物空間中， 位于調(diào)焦物平面前后一定距離內(nèi)的景物， 還能夠結(jié)成相對清晰的影像。 上述 位于調(diào)焦物平面前后的能結(jié)成相對清晰影像的景物間之縱深距離，也就是能在實(shí)際像平面上 獲得相對清晰影像的景物空間深度范圍，稱為景深。最大相對孔徑與光圈系數(shù)：相對孔徑， 是指該鏡頭的入射光孔直徑（用D表示）與焦距（用f表示）之比，即：相對孔徑=D/ f。相對孔4徑的倒數(shù)稱為光圈系數(shù)（aperture scale），又稱為f/制光圈系數(shù)或光孔號碼。一般鏡 頭的相對孔徑是可以調(diào)節(jié)的，其最大相對孔徑或光圈系數(shù)往往標(biāo)

12、示在鏡頭上，如1:1.2或f/1.2。如果拍攝現(xiàn)場的光線較暗或曝光時(shí)間很短，則需要盡量選擇最大相對孔徑較大的鏡 頭。鏡頭各參數(shù)間的相互影響關(guān)系一個(gè)好的鏡頭， 在分辨率、明銳度、 景深等方面都有很好的體現(xiàn)， 對各種像差的校正也比較 好，但同時(shí)其價(jià)格也會幾倍甚至上百倍的提高。 如果我們掌握一些規(guī)律和經(jīng)驗(yàn)， 就可以使用 同檔次的鏡頭達(dá)到更好的效果。1.焦距大小的影響情況 焦距越小，景深越大;焦距越小，畸變越大;焦距越小，漸暈現(xiàn)象越嚴(yán)重，使像差邊緣的照度降低;2.光圈大小的影響情況光圈越大，圖像亮度越高;光圈越大，景深越小;光圈越大，分辨率越高;3.場中央與邊緣 一般像場中心較邊緣分辨率高 一般像場中

13、心較邊緣光場照度高4.光波長度的影響 在相同的攝像機(jī)及鏡頭參數(shù)條件下，照明光源的光波波長越短，得到的圖像的分辨力越高。所以在需要精密尺寸及位置測量的視覺系統(tǒng)中， 盡量采用短波長的單色光作為照明光源， 對 提高系統(tǒng)精度有很大的作用。*（1）顯微鏡的主要性能1分辨力：也稱分辨本領(lǐng)，是指區(qū)分兩個(gè)物點(diǎn)之間的最小距離的能力。能把兩點(diǎn)分辨開的最小距離叫分辨距離。 分辨距離越小， 則分辨力越 高；相反則低， 所以， 分辨力以分辨距離來表示 。 一般肉眼的分辨距 離為0.25mm左右，所以比這個(gè)距離小的兩點(diǎn)會被誤看成一點(diǎn)。顯微 鏡也有它的分辨距離和分辨力，這是顯微鏡性能中最重要的指標(biāo)，它 主要由物鏡性能所決定

14、。顯微鏡的分辨距離跟照明光的波長和物鏡鏡 口率有關(guān)，可以用如下公式表示：分辨距離（R） =0 61入/ NA入：照明光波長NA:物鏡鏡口率從上式可見： 照明光波越短，物鏡鏡口率越大，分辨力越高 。一 般可見光的彼長范圍為400700nm,若使用鏡口率為1.25油鏡，用 可見光中最短波長的紫色光，則分辨距離約為0.2卩m,這是一般光學(xué)顯微鏡分辨力極限。用高速電子束（其波長短到0.005nm）作為電子顯微鏡照明,分辨力可達(dá)0.2nm左右。比光學(xué)顯微鏡分辨力提高1000倍。52鏡像亮度： 鏡像亮度與物鏡鏡口率平方成正比, 與總放大倍數(shù)成反 比,即鏡口率越大, 鏡像亮度越大；總放大倍數(shù)越高, 鏡像亮度越小 。所以,總放大倍敢相同情況下,要使鏡像亮度增加,就應(yīng)使用鏡口率 的物鏡與低倍目鏡配合。 例如：總放大倍數(shù)都是200倍,則用鏡口率 為0.65的40X 物鏡與5X 目鏡配合，其鏡像亮度比使用鏡口率為0.25的10X 物鏡與20X 目鏡的鏡像亮度高6.75倍。因目