AYL~S7~345血液與骨髓標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范流程3.0

1、 編寫者：沈繼錄審核者： 批準(zhǔn)人： 生效日期：2012.1.1文件發(fā)放范圍：微生物組文件年度審核審核者：審核者：審核者：審核者：日期：日期：日期：日期：血液及骨髓標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1目的規(guī)范血液及骨髓標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。2適用范圍血液及骨髓。3標(biāo)本3.1 標(biāo)本類型 血液及骨髓。3.2 標(biāo)本采集3.2.1 采血時(shí)間 抗菌藥物治療前，發(fā)熱初期或高峰時(shí)抽血。3.2.2 采血頻率 對(duì)懷疑菌血癥的成年病人，推薦同時(shí)在不同部位采集23套(每套包括一瓶需氧瓶、一瓶厭氧瓶或者兩套需氧瓶)，對(duì)感染性心內(nèi)膜炎和真菌血癥則應(yīng)多次采集；嬰幼兒病人，推薦同時(shí)在不同部位采集2套，可不

2、做厭氧培養(yǎng)。3.2.3 采血量 以培養(yǎng)基的110為宜，成人一次采血510 ml，嬰幼兒為12 m1。3.2.4 骨髓標(biāo)本 用骨髓穿刺針從髂骨采集。3.3標(biāo)本拒收標(biāo)準(zhǔn)3 31血培養(yǎng)瓶破裂或有明顯污染。3 3 2 培養(yǎng)瓶標(biāo)識(shí)與化驗(yàn)申請(qǐng)單不符。33 3用過期的培養(yǎng)瓶采集標(biāo)本、采血量不足等。3.3.4 對(duì)于不合格標(biāo)本，應(yīng)及時(shí)通知采集人員重新留取標(biāo)本。3.4 標(biāo)本保存 采集標(biāo)本后立即送到實(shí)驗(yàn)室，不能及時(shí)送檢可置室溫，切勿放冰箱。冬季血培養(yǎng)瓶在送檢過程中應(yīng)采取一定的保暖措施。4試劑、儀器4.1 革蘭染液、氧化酶試劑、3過氧化氫、血瓊脂平板、巧克力平板、麥康凱平板、相關(guān)生化試劑等。4.2 BACTAlert

3、 3D或BACTEC 9000全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)、VITEK鑒定系統(tǒng)。成人需氧血培養(yǎng)瓶、厭氧血培養(yǎng)瓶、兒童血培養(yǎng)瓶、革蘭陰性菌鑒定卡(GNI+)、革蘭陰性菌藥敏卡(GNS)、革蘭陽性菌鑒定卡(GPI)、革蘭陽性菌藥敏卡(GPS)、真菌鑒定卡(YBC)、藥敏紙片、ATB板條等。4.3 接種針、接種環(huán)、電熱灼燒器、顯微鏡、孵育箱、C02培養(yǎng)箱等。4.4 試劑的有效期和使用參照試劑說明書。5細(xì)菌鑒定和藥敏質(zhì)控參見質(zhì)量管理程序。6檢驗(yàn)步驟接收標(biāo)本后，立即對(duì)標(biāo)本進(jìn)行編號(hào)、登記。門診病人要同時(shí)登記住址，聯(lián)系電話等病人信息。6.1自動(dòng)化培養(yǎng) 將血培養(yǎng)瓶置全自動(dòng)血培養(yǎng)儀中。當(dāng)標(biāo)本有菌生長時(shí)，儀器發(fā)出陽性報(bào)警，應(yīng)

4、立即用無菌注射器抽取瓶內(nèi)培養(yǎng)液作直接涂片革蘭染色，鏡檢，將結(jié)果向臨床醫(yī)師報(bào)告，同時(shí)轉(zhuǎn)種血瓊脂平板、麥康凱平板（或中國藍(lán)平板）或加做巧克力平板，并進(jìn)行直接藥敏試驗(yàn)，置35、5C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)1824小時(shí)。從瓊脂平板上挑取菌落進(jìn)行涂片染色及觸酶和氧化酶試驗(yàn)。革蘭陽性菌和革蘭陰性菌分別選用GPI及GNI上機(jī)進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)或者做KB法藥敏試驗(yàn)(具體操作見藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程)。6.2手工培養(yǎng)6.2.1將血培養(yǎng)瓶置35孵育箱，經(jīng)1820小時(shí)孵育在血瓊脂平板或巧克力平板上盲目轉(zhuǎn)種一次。6.2.2盲目轉(zhuǎn)種后，培養(yǎng)瓶繼續(xù)孵育至第5日，每日觀察一次有無菌生長，并搖勻繼續(xù)培養(yǎng)，下列幾種情況提示有細(xì)菌生長

5、(表528)。表528培養(yǎng)瓶中有細(xì)菌生長時(shí)的不同反應(yīng)根據(jù)肉眼觀察，對(duì)有細(xì)菌生長跡象，取菌懸液涂片作革蘭染色，同時(shí)分離培養(yǎng)，接種需氧血瓊脂平板、麥康凱平板（或中國藍(lán)平板）或加做巧克力平板，并進(jìn)行直接藥敏試驗(yàn)，置35、5CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1824小時(shí)。次日純培養(yǎng)再進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)。6 3特殊培養(yǎng)6.3 1布魯菌屬 通常將血液接種到雙相血培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)為510CO2，35，每48小時(shí)觀察有無細(xì)菌生長，若無細(xì)菌生長應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)，陰性應(yīng)培養(yǎng)至30日后才可發(fā)出報(bào)告。6.3.2乏養(yǎng)菌 該細(xì)菌生長需要巰醇復(fù)合物和維生素B6。在血培養(yǎng)基中需加鹽酸一磷酸吡多醛(0001)或L-半胱氨酸 (O.05O.1)或兩

6、者皆有，否則乏養(yǎng)菌不能生長。血培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種血瓊脂平板上，然后交叉劃線接種金黃色葡萄球菌，靠近金黃色葡萄球菌有乏養(yǎng)菌生長。6.3.3 L型細(xì)菌 在培養(yǎng)基中含有10蔗糖或甘露醇時(shí)，才適合L型細(xì)菌生長。6.3.4 心內(nèi)膜炎特殊致病菌 如果常規(guī)血培養(yǎng)72小時(shí)陰性而病人臨床癥狀仍提示感染性心內(nèi)膜炎，應(yīng)提高培養(yǎng)基的營養(yǎng)或補(bǔ)加添加劑。有利于分離營養(yǎng)要求苛刻、生長緩慢的革蘭陰性桿菌，如人心桿菌、侵蝕艾肯菌、金氏菌、伴放線桿菌、軍團(tuán)菌等細(xì)菌，應(yīng)延長培養(yǎng)至24周，然后轉(zhuǎn)種特殊的培養(yǎng)基。 、6.3.5 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) 參見分枝桿菌屬檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。7操作流程血液、骨髓置血培養(yǎng)儀需氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)培養(yǎng)儀報(bào)警，調(diào)取培養(yǎng)

7、物耐氧試驗(yàn)涂片、染色細(xì)菌種類轉(zhuǎn)種平板35培養(yǎng)18-24h直接藥敏一級(jí)報(bào)告觀察菌落特征及涂片、染色二級(jí)報(bào)告儀器或手工細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)三級(jí)報(bào)告（最終報(bào)告）8結(jié)果報(bào)告8.1 陽性結(jié)果報(bào)告 報(bào)告通常分為三級(jí)。8.1.1 一級(jí)報(bào)告 陽性報(bào)警血培養(yǎng)瓶應(yīng)進(jìn)行涂片革蘭染色，將涂片結(jié)果電話(或其他方式)通知臨床，同時(shí)記錄報(bào)告的日期、時(shí)間、內(nèi)容以及接收?qǐng)?bào)告人的姓名。血培養(yǎng)陽性應(yīng)列為危急值。8.1.2 二級(jí)報(bào)告 報(bào)告直接藥敏試驗(yàn)結(jié)果。直接藥敏試驗(yàn)，將血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行革蘭染色，如涂片找到細(xì)菌，根據(jù)革蘭染色結(jié)果選擇藥敏所用培養(yǎng)基(Muller一Hinton培養(yǎng)基或含5羊血Muller一hinton瓊脂平板)，取陽性

8、肉湯標(biāo)本約0.2 ml，用無菌棉簽均勻涂布于瓊脂表面，根據(jù)革蘭染色結(jié)果選擇所用抗菌藥物的紙片，如鏡檢見革蘭陰性桿菌，選擇腸桿菌科常用的抗菌藥物紙片；若為革蘭陽性球菌，成對(duì)排列，選擇葡萄球菌用的抗菌藥物紙片。然后置35，孵育67小時(shí)讀取初步藥敏結(jié)果。次日純培養(yǎng)再進(jìn)行菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)，發(fā)送最終報(bào)告。 最終結(jié)果如與初步報(bào)告不符，應(yīng)及時(shí)與臨床溝通，并在書面最終報(bào)告注明變更內(nèi)容。8.1.3 三級(jí)報(bào)告 報(bào)告細(xì)菌種屬、藥敏試驗(yàn)、結(jié)果評(píng)價(jià)和建議。 8.2 陰性結(jié)果報(bào)告 血培養(yǎng)72小時(shí)未見細(xì)菌生長，應(yīng)通知臨床醫(yī)師，以便作相應(yīng)處理，但培養(yǎng)瓶要繼續(xù)培養(yǎng)至第5日，方可發(fā)出陰性報(bào)告。如果發(fā)現(xiàn)有菌生長，可補(bǔ)發(fā)報(bào)告。 8

9、.3 對(duì)發(fā)出報(bào)告進(jìn)行銷號(hào)，并作好菌名或無菌及報(bào)告日期登記。 8.4 傳染病(傷寒沙門菌)報(bào)醫(yī)務(wù)部和(或)防?？啤?8.5 傳染病菌種保存(傷寒沙門菌)，交疾病控制中心復(fù)核。 9注意事項(xiàng) 9.1 抽血后無需更換針頭即可注入血培養(yǎng)瓶中。 9.2 抽血前即應(yīng)貼好標(biāo)簽，標(biāo)簽不能覆蓋條形碼。 9.3 若不能立即送至實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)置于35溫箱或室溫，絕不可放置于冰箱。 9.4 有自動(dòng)血培養(yǎng)儀的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)建立24小時(shí)值班制，可及時(shí)處理陽性報(bào)警標(biāo)本。 9.5 如不同部位采集的兩瓶血培養(yǎng)瓶出現(xiàn)一瓶陽性一瓶陰性，或者出現(xiàn)兩瓶均為陽性，檢測結(jié)果均為凝固酶陰性葡萄球菌，這兩種情況都應(yīng)該向臨床報(bào)告和溝通。 10臨床意義 引起敗血癥的多為耐藥性金黃色葡萄球菌、某些革蘭陰性桿菌及部分球菌；癤、癰、膿腫和化膿性骨髓炎繼發(fā)的敗血癥主要由金黃色葡萄球菌和溶血鏈球菌引起；尿道、膽道、胃腸道炎癥和黏膜損傷引起的敗血癥以大腸埃希菌最常見；燒傷后銅綠假單胞菌和