CEA實時熒光定量RT(1)

1、CEA實時熒光定量RT(1)】 目的：評價手術(shù)操作促進(jìn)肺癌細(xì)胞入血的可能性，分析圍手術(shù)期外周循環(huán)癌細(xì)胞（CTCs）的變化與常見臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系. 方法：接受根治性手術(shù)的原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者23例，按預(yù)定的結(jié)扎血管順序術(shù)前將病例任意分為先結(jié)扎肺靜脈組和先結(jié)扎肺動脈組. 分別采集其術(shù)前1 d、術(shù)中及術(shù)后第7日外周血標(biāo)本. 選擇10例需手術(shù)治療的肺部良性疾病患者作為對照. 以20例健康人作為陰性對照. 以癌胚抗原（CEA）作為檢測標(biāo)志物，運用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(fqRTPCR)法定量檢測患者CTCs的存在狀況. 結(jié)果：圍手術(shù)期外周血CEA mRNA濃度變化呈上升趨勢,

2、術(shù)后第7日顯著高于術(shù)前1 d(P=0.000)及手術(shù)當(dāng)天(P=0.000). 肺腺癌術(shù)前CEA mRNA明顯高于肺鱗癌（P=0.0375）. 先結(jié)扎肺靜脈組與先結(jié)扎肺動脈組比較存在明顯差異(P=0.045). 術(shù)前T分期與圍手術(shù)期CEA測值間亦存在密切關(guān)系（P=0.025）. 術(shù)前陽性率為43.5%（10/23），而手術(shù)對照組及健康組均為陰性. 結(jié)論：可手術(shù)切除的NSCLC患者手術(shù)前就可能存在全身癌細(xì)胞的播散. 肺癌細(xì)胞主在術(shù)后逐漸釋放入外周循環(huán). 外科手術(shù)操作可促使癌細(xì)胞術(shù)中入血，若先結(jié)扎肺靜脈可一定程度阻止癌細(xì)胞釋放.【關(guān)鍵詞】 肺腫瘤；血液；聚合酶鏈反應(yīng)；癌胚抗原；信使RNA；圍手術(shù)期0

3、引言肺癌手術(shù)中在結(jié)扎肺動脈以前結(jié)扎肺靜脈可能是防止術(shù)中肺癌細(xì)胞被擠入血的有效方法1. 本實驗中，我們以癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）作為檢測標(biāo)志物，運用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescent quantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction，fqRTPCR）法定量檢測了術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)患者外周血中癌細(xì)胞的存在狀況，以評價手術(shù)操作促進(jìn)癌細(xì)胞入血的可能性，同時分析了圍手術(shù)期外周循環(huán)癌細(xì)胞（

4、circulating tumor cells，CTCs）的變化與常見臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系.1材料和方法1.1材料本組病例包括接受根治性手術(shù)的23例原發(fā)性NSCLC患者，分別采集術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后外周血標(biāo)本共69份. 術(shù)前標(biāo)本在手術(shù)前1 d采集，術(shù)中標(biāo)本則在肺癌被切除以后采集，術(shù)后標(biāo)本在術(shù)后7 d獲取. 所有病例均經(jīng)病理學(xué)診斷證實. 所有病例術(shù)前均未接受過化療、放療等治療措施. 各病例臨床病理特征見表1. 以10例需接受手術(shù)治療的肺部良性疾病患者作為手術(shù)對照. 以20例健康人的外周血標(biāo)本作為陰性對照.按預(yù)定的結(jié)扎血管順序術(shù)前將病例任意分為先結(jié)扎肺靜脈組（PVfirst Group）和先結(jié)扎肺動脈

5、組（PAfirst Group）. 所有的手術(shù)操作均由同一外科小組完成. 術(shù)中進(jìn)入胸腔以后，首先完成肺血管的游離和結(jié)扎，肺葉切除完成以后隨之清除縱隔淋巴結(jié). 術(shù)后除1例因呼吸衰竭死亡外，其余患者均無并發(fā)癥發(fā)生.1.2方法1.2.1提取RNA首先運用人淋巴細(xì)胞分離液（上?；瘜W(xué)試劑二廠）分離外周血單個核細(xì)胞（PBMNs）. 按Trizol Reagent (Invitrogen,Cat15596026)的說明提取PBMNs 中的總RNA. 通過測定A260 nm計算RNA的濃度，A260 nm/A280 nm的值判定RNA純度，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性.1.2.2合成CDNA總RNA

6、在70中孵育5 min. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在18 L 1RT緩沖液50 mmol/L TrisHCl (pH 8.3), 75 mmol/L KCl及3 mmol/L MgCl2中完成, 同時加入0.5 mmol/L dNTP, 1 L RNasin及200 U MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega), 合成條件為37 30 min.作者：葛明建,時德吳慶琛,王梅,李強(qiáng),李良彬【關(guān)鍵詞】胞肺癌患【Abstract】AIM: To assess whether surgical man 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供

7、參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。1.2.3引物與探針用Primer Express軟件(PE Applied Biosystems)設(shè)計Taqman引物和探針. CEA的引物序列為: 上游引物(53) GCCTTGACAAAACGTTCCTGG; 下游引物(53) GAACGG CGTGGATTCAATAGTG. CEA探針序列(53)： AGTCTCCCTCGGCCGCTCCCCA. 產(chǎn)物長度為199 bp（s）.表1原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌患者23例的臨床病理特征1.2.4Taqman PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)在以下反應(yīng)體系中完成:43 L PCR反應(yīng)緩沖液10 m

8、mol/L TrisHCl (pH 8.4), 50 mmol/L KCl及1.5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTP, 5 L CDNA, 2 U Taq DNA聚合酶（Promega），上、下游引物各0.4 mol/L，首先在95水平預(yù)變性5 min，然后按以下反應(yīng)條件完成35個循環(huán)：95 30 s，62 20 s，72 20 s. 最后在72下延伸10 min結(jié)束反應(yīng). 在每一批PCR反應(yīng)中設(shè)立陽性對照（提自LC5細(xì)胞的RNA）及陰性對照（水）.根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各檢測標(biāo)本的起始濃度（基因拷貝數(shù)/毫升）. 實驗數(shù)據(jù)均以每毫升血清中CEAmRNA拷貝數(shù)的常用

9、對數(shù)表示. 所有反應(yīng)均在ABI Prism 7000序列檢測系統(tǒng)（PerkinElmer Applied Biosystem）中完成. 運用檢測系統(tǒng)自帶的軟件計算Ct值并確定每個標(biāo)本的起始拷貝數(shù).1.2.5LC5細(xì)胞連續(xù)稀釋試驗用TrypsinEDTA（Sigma）收集單層培養(yǎng)的LC5細(xì)胞(一種肺鱗癌細(xì)胞株)，用冷PBS洗滌并混懸. 用計數(shù)池測定細(xì)胞的密度，以臺盼藍(lán)（Sigma）染色評價細(xì)胞的活力. 調(diào)整細(xì)胞的密度至2 mL DEPC處理水中含106個細(xì)胞. 為了模仿肺癌患者外周循環(huán)中癌細(xì)胞存在的情況，分別從健康志愿者外周血107個PBMNs和106個LC5細(xì)胞中提取RNA，將提取自正常人10

10、6個PBMNs中的RNA分別與提取自1，10，102，103，104和105個LC5細(xì)胞的RNA相混合. 陰性對照，則只以提自106個PBMNs的RNA為檢測對象. 運用fqRTPCR法分別檢測以上RNA混合物的起始基因拷貝數(shù)，并以此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和受試者工作特征（receiver operator charicteristic,ROC）曲線. 每個濃度的標(biāo)本均重復(fù)測定3次.統(tǒng)計學(xué)處理： 用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包建立數(shù)據(jù)文件并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析. 采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析評估圍術(shù)期測值變化趨勢及分組變量與測值的關(guān)系. P0.05提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果2.1CEA診斷實驗的評估ROC曲線

11、下面積為0.850 (95%CI: 0.7090.991) (圖1). 將健康對照組均值的95%可信區(qū)間的上限（X 1.96SD）作為診斷實驗的分界值, 其值為4.6151. 在此分界值標(biāo)準(zhǔn)下，診斷實驗的靈敏度為91%，特異度為87%. 通過比較批間和批內(nèi)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值來評估檢測方法的重復(fù)性, 批間和批內(nèi)Ct(cycle threshold)值的變異系數(shù)(CV)分別為5.4%和2.7%. 圖2及圖3(熒光定量PCR的擴(kuò)增過程包括3個階段：基線期、指數(shù)期及平臺期. 當(dāng)報告基團(tuán)的熒光強(qiáng)度超過閾值時的循環(huán)數(shù)就是Ct值)分別顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增曲線.2.2圍手術(shù)期CEA測值變化趨勢圍手術(shù)期外周血

12、CEA mRNA濃度變化呈上升趨勢,術(shù)后第7日顯著高于術(shù)前1 d(4.870.18 vs 4.480.16, P=0.000)及手術(shù)當(dāng)天(4.870.18 vs 4.540.25,P=0.000). 手術(shù)當(dāng)天測值與術(shù)前1 d比較無顯著差異.2.3術(shù)前CEA mRNA水平與組織類型間的關(guān)系肺腺癌患者(n=9)術(shù)前外周血中CEA mRNA明顯高于肺鱗癌患者n=14（4.700.16 vs 4.340.54, t=1.873, P=0.0375, 組間t檢驗）. 采用組間t檢驗法分析術(shù)前外周血CEA mRNA濃度與患者性別、年齡、手術(shù)部位及pTNM分期等間的關(guān)系,差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）.2.

13、4圍手術(shù)期外周血CEA mRNA水平與血管結(jié)扎順序及T分期間的關(guān)系先結(jié)扎肺靜脈組與先結(jié)扎肺動脈組比較圍術(shù)期外周血CEA mRNA測值可能存在差異(4.400.32 vs 4.820.48, P=0.045). 術(shù)前T分期與圍術(shù)期CEA測值間亦存在一定關(guān)系, T分期越晚,則CEA mRNA水平越高（4.270.28 vs 4.760.37, P=0.025）.2.5術(shù)前外周血CEA陽性率以健康對照組均值的95%可信區(qū)間的上限值為分界值, 若測值4.6151為陽性. 則術(shù)前23例患者中有10例為陽性,陽性率為43.5%.3討論CEA被認(rèn)為是一種腫瘤特異性的標(biāo)志物，它在胚胎時期的結(jié)腸以及各種腫瘤組織

14、中表達(dá)，并且與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系2. 不少研究者將其作為檢測肺癌患者外周血CTCs的標(biāo)志物3-4. 由于有些研究者發(fā)現(xiàn)CEA在正常組織亦有表達(dá)，因此目前CEA是否一定是屬腫瘤特異性標(biāo)志物尚存在爭議2. Giesing等5則非?？隙ǖ卣J(rèn)為CEA屬于腫瘤特異性的. 如今，基于mRNA基礎(chǔ)上的癌細(xì)胞鑒別技術(shù)的主局限性就在于大多數(shù)標(biāo)志物的組織特異性不夠. 在沒有發(fā)現(xiàn)特異性很理想的標(biāo)志物的前提下，克服這一問題，只有建立定量檢測的方法. 此時，存在于非腫瘤細(xì)胞內(nèi)的低水平表達(dá)可被視為閾值（Threshold）6. 本實驗我們是建立在這樣一種假設(shè)基礎(chǔ)上的，即CEA在正常組織中有表達(dá)，但與含有轉(zhuǎn)移性肺癌的組

15、織相比，它是微不足道的. 一旦它在外周血中的表達(dá)超過某一假定的水平，則提示有腫瘤細(xì)胞存在.由于傳統(tǒng)的RTPCR法最多只能達(dá)到半定量的程度，因此它很難區(qū)分正常組織中靶基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平與癌相關(guān)組織中增高的表達(dá)水平，從而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生. 我們以CEA作為檢測標(biāo)志物，運用fqRTPCR法來檢測CTCs，以便為動態(tài)監(jiān)測疾病、觀察療效及早期診斷等創(chuàng)造條件. 能夠獲得CTCs的定量信息是一個很大的進(jìn)步. 與傳統(tǒng)定量PCR相比，實時定量PCR具有自己獨特的優(yōu)點7. 這項技術(shù)還被運用于腫瘤患者骨髓和淋巴結(jié)中微轉(zhuǎn)移的檢測8-10. 該法的重特征之一就是在PCR產(chǎn)物擴(kuò)增過程中實時得出產(chǎn)物的量，這一點與終點檢測法

16、完全不同，后者是只有當(dāng)反應(yīng)完成預(yù)設(shè)循環(huán)數(shù)后才計算產(chǎn)物的累積數(shù)量. 靶基因的起始拷貝數(shù)越高，則反應(yīng)過程中能被監(jiān)測到的增高的熒光信號就越早. 通過測定Ct值就能夠知道待測樣品中靶基因的拷貝數(shù)，運用標(biāo)準(zhǔn)曲線可獲得它的起始拷貝數(shù). 為了區(qū)分陽性結(jié)果是由于存在CTCs還是正常PBMNs的低水平表達(dá)所致，我們將健康對照組實驗結(jié)果均值的95%可信區(qū)間的上限值作為真陽性標(biāo)準(zhǔn). 這樣可對待測標(biāo)本的標(biāo)志物進(jìn)行定量分析，可克服傳統(tǒng)RTPCR的技術(shù)缺點及一定程度上解決標(biāo)志物的非特異性問題.本研究結(jié)果表明，術(shù)前患者外周血CEA mRNA水平與NSCLC患者的組織類型間存在密切關(guān)系，提示肺癌的組織類型不同時，其生物學(xué)行為

17、亦會有差異. 因此，在臨床診療過程中，應(yīng)區(qū)別對待不同的情形，即遵循“個體化”治療的原則，對于肺腺癌患者可給予術(shù)后全身性輔助治療，以獲得更好的療效. 我們沒有發(fā)現(xiàn)實驗結(jié)果與癌腫的術(shù)后pTNM分期間存在相關(guān)性，這也一定程度上解釋了為何有些病理分期屬早期（/）的肺癌患者術(shù)后很早就出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的臨床現(xiàn)象. 同時提示目前的pTNM分期系統(tǒng)尚不完善，可考慮將一些新的有價值的因素（如CTCs）納入現(xiàn)行分期系統(tǒng)中.作者：葛明建,時德吳慶琛,王梅,李強(qiáng),李良彬【關(guān)鍵詞】胞肺癌患【Abstract】AIM: To assess whether surgical man 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)

18、絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。本組患者圍手術(shù)期外周血CEA mRNA與T分期有密切關(guān)系. 癌腫越大，術(shù)后血行播散的癌細(xì)胞就越多. 推測其可能為癌腫體積越大，術(shù)中受機(jī)械壓迫就越多，癌細(xì)胞入血就越多. Yamashita等11的研究也一定程度上支持本實驗結(jié)果.23例患者中的10例術(shù)前CEA mRNA表達(dá)陽性，提示臨床上認(rèn)為可“根治性切除”的肺癌患者術(shù)前就存在CTCs. 臨床觀察發(fā)現(xiàn)，對呈明顯“局限型”表現(xiàn)的原發(fā)瘤實施根治性切除后，仍有相當(dāng)一部分患者術(shù)后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提示這部分患者可能術(shù)前

19、就存在不能被目前常規(guī)檢查手段發(fā)現(xiàn)的播散性癌細(xì)胞. 在癌腫生長的早期階段，隱匿性癌細(xì)胞即可通過血行或淋巴途徑擴(kuò)散，而這一現(xiàn)象往往被現(xiàn)今的臨床和病理分期手段所忽略. 雖然本實驗方法不允許對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性鑒定，但是實驗結(jié)果還是提示有相當(dāng)比例的可切除NSCLC患者中存在全身性癌細(xì)胞播散.術(shù)中癌細(xì)胞播散入血經(jīng)常發(fā)生12-13. 本實驗結(jié)果顯示，肺血管結(jié)扎順序與圍手術(shù)期CEA mRNA表達(dá)細(xì)胞入血間存在較密切的關(guān)系（P=0.075,2sided）. 我們認(rèn)為外科手術(shù)操作可促使術(shù)中和術(shù)后癌細(xì)胞入血，而術(shù)中先結(jié)扎肺靜脈可能有助于減少癌細(xì)胞脫落入血.我們認(rèn)為，作為一種診斷手段，檢測微轉(zhuǎn)移或CTCs使得實時監(jiān)

20、測腫瘤成為可能，并且可能對腫瘤的個體化治療產(chǎn)生很大影響. 傳統(tǒng)檢測方法（如影像學(xué)方法）只能了解臨床轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)以后的情況，無法明確從原發(fā)瘤切除以后至轉(zhuǎn)移形成以前這段時間的情況. 隨著PCR等新的檢測手段不斷發(fā)展，微轉(zhuǎn)移的檢測可能填補(bǔ)存在于原發(fā)瘤與轉(zhuǎn)移灶之間的這條鴻溝，從而提高腫瘤療效.【參考文獻(xiàn)】1 Ge MJ，Shi D，Wu QC，et al. Observation of circulating tumour cells in patients with nonsmall cell lung cancer by realtime fluorescent quantitative rever

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