實(shí)驗(yàn)八 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?.掌握掌握TRIZol試劑法提取細(xì)胞總試劑法提取細(xì)胞總RNA的原理和實(shí)驗(yàn)步驟；的原理和實(shí)驗(yàn)步驟；2. 掌握反轉(zhuǎn)錄掌握反轉(zhuǎn)錄RT的基本原理和操作步驟。的基本原理和操作步驟?？偪俁NA提取提取反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄（RT）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測目的基因的表達(dá)：檢測目的基因的表達(dá)： 通過變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機(jī)通過變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機(jī)溶劑抽提溶劑抽提RNA，樣品分成水樣層和有機(jī)層，樣品分成水樣層和有機(jī)層，RNA存在于存在于水樣層中。收集水樣層后，通過異丙醇沉淀水樣層中。收集水樣層后，通過異丙醇沉淀RNA，再經(jīng)，再經(jīng)過洗滌、晾干、

2、最后溶解等步驟即得到相對(duì)較純的過洗滌、晾干、最后溶解等步驟即得到相對(duì)較純的RNA。 反轉(zhuǎn)錄是在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以總反轉(zhuǎn)錄是在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以總RNA中中mRNA為為模板合成模板合成cDNA的過程。的過程。 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：1TRIzol試劑：主要成分是苯酚，它能裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋試劑：主要成分是苯酚，它能裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚并得到釋放。此外，白、核酸物質(zhì)解聚并得到釋放。此外，TRIzol中還有中還有8-羥基喹啉、羥基喹啉、異硫氰酸胍、異硫氰酸胍、-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase。2氯仿：與酚一起作用，使蛋白質(zhì)變性；抽提水相中殘留的

3、酚，氯仿：與酚一起作用，使蛋白質(zhì)變性；抽提水相中殘留的酚，減少減少RNA損失。損失。3異丙醇：沉淀核酸。異丙醇：沉淀核酸。475乙醇乙醇DEPC水配制）：去除水配制）：去除RNA沉淀中的鹽分。沉淀中的鹽分。試劑的用途：試劑的用途：實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：1. 取取1/3小鼠完整肝組織約小鼠完整肝組織約1g），直接加入），直接加入4mL TRIzol試劑。試劑。用勻漿器進(jìn)行勻漿處理，室溫放置用勻漿器進(jìn)行勻漿處理，室溫放置5分鐘分鐘,每組取每組取0.5mL 。2. 加入加入0.1mL氯仿，劇烈振蕩氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置，室溫放置3min。3. 10000rpm離心離心5min，RNA主要在上層

4、水相中。轉(zhuǎn)移主要在上層水相中。轉(zhuǎn)移0.3mL水相至新的離心管中。水相至新的離心管中。4.加入加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置5 min。5. 10000rpm離心離心5 min，棄上清。，棄上清。6. 加入加入1mL 75乙醇，輕輕洗滌乙醇，輕輕洗滌RNA沉淀，沉淀，10000rpm離心離心5min，棄上清。，棄上清。7. 室溫晾干室溫晾干(約約510min)。8. 加入加入100L無無RNase水溶解水溶解RNA，取，取50L用于用于A260和和A280值測定。值測定。9. 計(jì)算計(jì)算RNA的濃度和的濃度和A260/A280值值總總RNA提取提取1只小鼠只小鼠

5、/小班，小班，3個(gè)勻漿器個(gè)勻漿器/小班小班（1在在0.2mL微量離心管中配制混合液微量離心管中配制混合液試劑試劑使用量使用量Oligo dT Primer 1 L dNTP Mixture 1 LTotal RNA 15g RNase free dH2O 補(bǔ)水到補(bǔ)水到 10 L10 L（2輕輕混勻，離心，將樣品沉至管底后，輕輕混勻，離心，將樣品沉至管底后，65水浴保溫水浴保溫5分鐘，分鐘，然后迅速冰浴冷卻。然后迅速冰浴冷卻。反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄RT）以下操作在冰上進(jìn)行。以下操作在冰上進(jìn)行。（3往上述管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液往上述管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液試劑試劑使用量使用量上述變性后反應(yīng)液上述變性后反應(yīng)

6、液10 L5 PrimeScriptBuffer4 LRNase Inhibitor0.5 L (20 U)PrimeScriptRTase1 LRNase free dH2O5.5L（4緩慢混勻，稍稍離心將樣品沉至管底，按下列條件進(jìn)行反緩慢混勻，稍稍離心將樣品沉至管底，按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42保溫保溫3060分鐘，分鐘，70保溫保溫15分鐘，然后冰上冷卻。分鐘，然后冰上冷卻。1.提取總提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄的整個(gè)過程都要嚴(yán)格控制和反轉(zhuǎn)錄的整個(gè)過程都要嚴(yán)格控制RNase的污染。的污染。操作者要配帶口罩、帽子和手套。所有用到的塑料和玻璃器皿均操作者要配帶口罩、帽子和手套。所有用到的

7、塑料和玻璃器皿均需要滅活需要滅活RNase。2. 反轉(zhuǎn)錄中，迅速冰浴的操作一定要快，不能是溫度緩慢下降，反轉(zhuǎn)錄中，迅速冰浴的操作一定要快，不能是溫度緩慢下降，否則否則RNA可能局部復(fù)性降低反轉(zhuǎn)錄的效率。可能局部復(fù)性降低反轉(zhuǎn)錄的效率。3.反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)中對(duì)反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)中對(duì)RNA濃度有比較高的要求，因此必需測定濃度有比較高的要求，因此必需測定RNA濃度。只有保證濃度。只有保證RNA濃度在合適的范圍內(nèi)才能提高擴(kuò)增的成濃度在合適的范圍內(nèi)才能提高擴(kuò)增的成功幾率。功幾率。本卷須知本卷須知:28S18S5S,5.8S 1 2（A）（B）(A)細(xì)胞總細(xì)胞總RNA的制備的制備; (B)RT-PCR分析分析TBX5在不同細(xì)胞中的表達(dá)在不同細(xì)胞中的表達(dá)思考題：思考題： R