反義熱休克蛋白90β對(duì)HeLa細(xì)胞惡性表型和藥敏感性的影響

1、    反義熱休克蛋白90對(duì)HeLa細(xì)胞惡性 表型和藥敏感性的影響        【摘要】目的探討和研究熱休克蛋白90(hsp90)與腫瘤惡性表型和耐藥性的關(guān)系。方法將hsp90正義、反義表達(dá)質(zhì)粒及pLXSN空載體，lipofectin法轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。G418抗性篩選。臺(tái)盼藍(lán)染色法，繪細(xì)胞生長(zhǎng)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。軟瓊脂細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞惡性表型。結(jié)果轉(zhuǎn)染正義hsp90表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞及HeLa細(xì)胞差別不大。而轉(zhuǎn)染hsp9

2、0反義表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞生長(zhǎng)慢于對(duì)照組細(xì)胞，對(duì)常用的化療藥物阿霉素（ADM）、順鉑（CDDP）的藥敏感性比對(duì)照組細(xì)胞明顯升高，其半致死劑量?jī)H為后兩者的1/2和1/5；軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染反義hsp90表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞集落形成能力減弱。結(jié)論反義hsp90在一定程度上抑制了HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低HeLa細(xì)胞惡性表型，明顯增強(qiáng)HeLa細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。【主題詞】熱休克蛋白90；HeLa細(xì)胞；藥物敏感性The effect of antisense hsp90 on the malignant phenotype and sensitivity of HeLa cells to chemothe

3、rapeutic drugsHUANG Changzhi, ZHOU Chun, ZHAO Mei, et al.（ Cancer Institute (Hospital), Chinese Academy Medical Science, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China）【Abstract】ObjectiveTo study the effects of hsp90 on tumorigenesis and sensitivity of HeLa cells to chemotherapeutic drugs. Meth

4、odsA recombinant plasmid expressing either sense or antisense hsp90 RNA, and a vector pLXSN were transfected into HeLa cell line by lipofectin method. The transfected cells were screened by G418. The growth rates of the transfected HeLa cells and their sensitivity to adriamycin(ADM) and cisplatin(CD

5、DP) were examined by cell count and MTT uptake. Colony formation in soft agar was used to embody the malignant phenotype in vitro. ResultsThere was little difference between HeLa cells transfected with sense RNA plasmids and pLXSN vector. The growth rate of HeLa cells transfected with antisense RNA

6、declined, and their ability to form colony in soft agar was decreased. The sensitity of the antisense hsp90 transfected HeLa cells to ADM and CDDP increased 2.15.8 fold; the LD50 decreased to 1/21/5 that of the wild-type HeLa cells.ConclusionHsp90 is involved in the maintenance of malignant phenotyp

7、e and drug resistance in HeLa cells.【Subject words】hsp90; HeLa cells; Drug sensitivity人HSP90家族是較為豐富的一類胞漿蛋白1。以是否含有豐富的谷氨酰胺片段而分為HSP90和HSP90兩類，分別由730和724個(gè)氨基酸組成。目前尚不清楚HSP90在細(xì)胞癌變過(guò)程中的作用，但許多報(bào)道證實(shí)，在喉癌等腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中HSP90表達(dá)異常2-4。HSP90能與多種轉(zhuǎn)化蛋白（如Src、Yes、Fes）形成復(fù)合物，與細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)5，6，因而我們利用反義RNA技術(shù)構(gòu)建了反義hsp90和正義hsp90重組質(zhì)粒，探討HS

8、P90對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性表型及藥敏感性的影響，為HSP90在腫瘤生物治療中進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方法1.材料和質(zhì)粒：RPMI-1640，Lipofectin reagent，G418購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；阿霉素（ADM），汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)明治醫(yī)藥有限公司，批號(hào)9706022，順鉑（CDDP），齊魯制藥廠，批號(hào)960702，由本所藥劑科提供；限制性內(nèi)切酶、PCR試劑盒、隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒等購(gòu)自美國(guó)Promega公司；HSP90單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Neo Marker公司。質(zhì)粒pUCH/GAL-hHSP90，含人全長(zhǎng)hsp90 cDNA，由加利福尼亞大學(xué)Dr.

9、Keith R. Yamamoto惠贈(zèng)。質(zhì)粒pLXSN，HeLa人宮頸癌細(xì)胞系，本實(shí)驗(yàn)室保存。2.正義hsp90和反義hsp90表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：用Dnasis軟件比較hsp90 cDNA和hsp90 cDNA的同源性，選定一段與hsp90 cDNA同源性較低的hsp90 200 bp cDNA區(qū)域，并進(jìn)一步在Genebank中比較了所選擇區(qū)域的特異性，這一段區(qū)域與相應(yīng)hsp90 cDNA的同源性為61%。用引物1：5 CGG GAT CCC GGG AGA AGG AAC GAG AGA AGG 3 引物2：5 CGG AAT TCC GGC ATG GTG TTG TTT AGT TCT 3

10、。PCR擴(kuò)增hsp90 200 bp cDNA區(qū)域，玻璃奶法回收DNA片段。平端插入pLXSN的Hpa位點(diǎn)。經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒，證明了重組質(zhì)粒中正義hsp90和反義hsp90插入方向的正確性。Southern、Northern和Western雜交證明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)。3.Lipofectin法轉(zhuǎn)染細(xì)胞：接種1×1052×105個(gè)細(xì)胞于60 mm培養(yǎng)瓶中，加4 ml含血清的培養(yǎng)基，于CO2孵箱中37培養(yǎng)24 h。在消毒試管中制備A液：10 g DNA加到1.5 ml RPMI-1640培養(yǎng)液中，B液：20 l Lipofectin 試劑加到1.5 ml RPMI

11、-1640培養(yǎng)液中，室溫放置45 min。輕輕混勻A、B液，室溫放置15 min。用無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基洗細(xì)胞。將A與B的混合液加到細(xì)胞中，CO2孵箱中37培養(yǎng)6 h。換2 ml含血清的RPMI-1640，CO2孵箱中37培養(yǎng)48 h。換液，加600 g/ml G418，繼續(xù)培養(yǎng)直至陽(yáng)性克隆形成。4.細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線：接種1×104細(xì)胞/瓶，每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)瓶，胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色后，計(jì)活細(xì)胞數(shù)，共計(jì)5 d，繪，重復(fù)3次。5.軟瓊脂細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)：用去離子水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低熔點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在37中。無(wú)菌制備出2×

12、DMEM（含有2倍抗生素和20%小牛血清），保存在37中。按11混合1.2%瓊脂糖和2×DMEM。取3 ml注入直徑6 cm的平皿中，冷卻凝固，置CO2孵箱中備用。胰酶消化細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。按11比例讓0.7%瓊脂和2×DMEM在無(wú)菌試管中相混，再向管中加入0.2 ml的細(xì)胞懸液，并充分混勻后注入含有1.2%瓊脂糖底層平皿中，待上層瓊脂凝固后，置37 CO2孵箱培養(yǎng)14 d。觀察細(xì)胞集落。6.MTT法檢測(cè)細(xì)胞藥物敏感性：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，Hank液洗滌2次，0.5%的胰酶消化，充分吹打成單細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。用培養(yǎng)基調(diào)整至2×105

13、/ml，每次取200 l接種到96孔板，培養(yǎng)12 h后，藥物作用。棄去培養(yǎng)基，每孔加10 l 5 mg/ml的MTT（用pH7.4 PBS配制5 mg/ml貯存液，配制后兩周內(nèi)使用），補(bǔ)充90 l無(wú)血清培養(yǎng)基，充分混勻，培養(yǎng)1 h。棄盡培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 l/孔，立即置微量振蕩器振蕩15 min，充分混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處吸光度值（A值，曾稱光密度OD值）。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值，根據(jù)A值計(jì)算出相對(duì)存活率。結(jié)果1.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)狀況：每組計(jì)數(shù)5 d，重復(fù)3次，取其平均數(shù)作曲線(1)。結(jié)果表明HeLa細(xì)胞、轉(zhuǎn)染有空載體pLXSN的HeLa細(xì)胞和轉(zhuǎn)

14、染有正義hsp90的HeLa細(xì)胞，三者的細(xì)胞生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差別，而轉(zhuǎn)染有反義hsp90細(xì)胞則比其他3種細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯緩慢。1轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)曲線2.反義hsp90能增加HeLa細(xì)胞的藥敏感性：應(yīng)用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的藥敏感性變化時(shí)，顯示出轉(zhuǎn)染有反義hsp90細(xì)胞對(duì)ADM和CDDP的藥敏感性增高(表1)。表1MTT測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)順鉑及阿霉素的藥敏感性細(xì)胞半致死劑量IC50(g/ml，±s)CDDPADM空載體細(xì)胞15.00±4.160.50±0.07正義hsp90細(xì)胞20.00±2.31*0.42±0.09*反義hsp90細(xì)胞

15、2.20±0.560.16±0.06*與空載體細(xì)胞相比，P>0.05與空載體細(xì)胞和正義hsp90細(xì)胞相比，P<0.013.反義hsp90能降低細(xì)胞的惡性表型：在軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)中，103細(xì)胞接種于直徑60 mm的軟瓊脂平板上，14 d后各組集落形成。結(jié)果對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組集落均數(shù)分別為83.0±2.0和69.2±2.3，轉(zhuǎn)染有反義hsp90的細(xì)胞集落形成能力下降16%（P0.05）。 討論HSP90與腫瘤關(guān)系密切，在腫瘤細(xì)胞中，HSP90呈現(xiàn)出高誘導(dǎo)表達(dá)4。HSP90與多種轉(zhuǎn)化蛋白形成復(fù)合物，并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)特定位點(diǎn)，這與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化密切

16、相關(guān)5，6。為了研究HSP90在腫瘤細(xì)胞中的作用，我們通過(guò)反義RNA技術(shù)研究了反義hsp90 RNA對(duì)腫瘤的惡性表型及耐藥性的影響。結(jié)果表明，反義hsp90在一定程度上抑制了HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)，而HeLa細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體pLXSN的細(xì)胞在生長(zhǎng)增殖方面差別不大。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染反義hsp90表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞集落形成能力減弱。推測(cè)反義hsp90 RNA在細(xì)胞內(nèi)抑制hsp90的表達(dá)，可能通過(guò)影響一些與腫瘤惡性表型相關(guān)的蛋白而起作用。多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是腫瘤進(jìn)行化療藥物治療時(shí)的一大障礙。熱休克蛋白可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在抗阿霉素的乳腺癌

17、細(xì)胞系中，HSP70、HSP27均高水平表達(dá)；預(yù)先誘導(dǎo)HSP27高表達(dá)的倉(cāng)鼠和人的細(xì)胞對(duì)化療藥物獲得抗性7。我們用化療藥物CDDP、ADM處理細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染反義hsp90的細(xì)胞藥敏感性明顯增強(qiáng)，說(shuō)明HSP90可能參與了細(xì)胞對(duì)化療藥物的抗性作用。耐藥性的產(chǎn)生可能與MDR基因的擴(kuò)增和Pgp蛋白的高表達(dá)相關(guān)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能增加藥物外排能力，使胞內(nèi)藥物濃度降低?？赡艿慕忉屖牵谵D(zhuǎn)染反義hsp90的細(xì)胞中，HSP90的表達(dá)受到一定程度的抑制。而大量新生Pgp蛋白的正確折疊和定位需要HSP90的參與，由于缺乏HSP90的分子伴侶作用，Pgp蛋白不能形成正確的構(gòu)象以發(fā)揮其外排藥物的功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)化療

18、藥物濃度比沒(méi)有轉(zhuǎn)染反義hsp90的細(xì)胞內(nèi)濃度高，說(shuō)明HSP90在維持Pgp的功能方面似乎起著主要的作用8?；痦?xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39770824）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基金資助項(xiàng)目（952011）作者單位：黃常志（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院，100021，北京）周純（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院，100021，北京）趙玫（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院，100021，北京）施一江（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院，100021，北京）喬繪紅（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院，100021，北京）

19、范云霞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院，100021，北京）茆燦泉（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院，100021，北京）徐楓（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院，100021，北京）袁興華（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院，100021，北京）參考文獻(xiàn)：1Bose S, Weikl T, Bugl H, et al. Chaperone function of Hsp90-associated proteins. Science, 1996,274:1715-1717.2施一江，趙玫，許先發(fā)，等.主要人熱休克蛋白在癌組織及癌旁正

20、常組織中表達(dá)水平的比較研究.中華腫瘤雜志，1998，20：277-279.3Xiao K, Liu W, Qu S， et al. Study of heat shock protein HSP90 alpha, HSP70, HSP27 mRNA expression in human acute leukemia cells. J Tongji Med Univ, 1996, 16:212-216.4Gress TM, Friederike MP, Weber C, et al. Differential expression of heat shock proteins in pancreatic carcinoma. Cancer Res, 1994, 54:547-551.5Pratt WB. The hsp90-bases chaperone system: involvement in sig