復元膠囊對軟骨細胞凋亡P38絲裂原活化蛋白激酶信號傳導通路的影響

1、復元膠囊對軟骨細胞凋亡P38絲裂原活化蛋白激酶信號傳導通路的影響         【摘要】  目的： 觀察復元膠囊含藥血清對體外培養(yǎng)軟骨細胞凋亡及P38絲裂原活化蛋白激酶信號通路（P38MAPK）的影響. 方法: 建立體外原代軟骨細胞培養(yǎng)體系,制備復元膠囊含藥血清,采用硝普鈉（SNP）誘導軟骨細胞凋亡，并用復元膠囊含藥血清以及P38MAPK的特異阻斷劑SB203580干預. 透射電鏡觀察軟骨細胞凋亡的超微結構，流式細胞儀檢測軟骨細胞凋亡率的變化，比色法觀察Caspase3活性變化，免疫印跡技術（Weste

2、rn Blot）檢測磷酸化P38, P53蛋白表達水平. 結果： 電鏡下可觀察到典型的凋亡細胞形態(tài)； 中藥組軟骨細胞凋亡率（29.18±0.81）%比模型組（39.73±0.55）%顯著降低，中藥+抑制劑組軟骨細胞凋亡率（25.85±0.85）%也比抑制劑組（27.27±0.78）% 低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P0.01，P0.05）； 中藥組凋亡執(zhí)行因子Caspase3的活性為（1.69±0.31） g/L，低于模型組（2.78±0.19） g/L，中藥+抑制劑組（0.95±0.06） g/L與抑制劑組（1.17±

3、;0.13） g/L比較，Caspase3的活性也降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P0.01，P0.05）； 中藥組pP38蛋白表達（0.84±0.06）與模型組（1.98±0.19）比較顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）；而中藥+抑制劑組pP38表達（0.32±0.03）與抑制劑組（0.36±0.04）比較無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）； P53蛋白在中藥組（2.78±0.34）表達明顯降低，與模型組（5.50±0.54）比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P0.01）；中藥+抑制劑組（0.92±0.02）與抑制劑（1

4、.41±0.09）組比較，P53蛋白表達也降低. 結論： 復元膠囊含藥血清能通過抑制磷酸化P38表達、調節(jié)P38信號通路下游靶基因P53和凋亡執(zhí)行因子Caspase3而抑制SNP誘導的軟骨細胞凋亡. 【關鍵詞】  軟骨細胞；細胞凋亡；P38絲裂原活化蛋白激酶類；復元膠囊0引言軟骨細胞是關節(jié)軟骨中唯一的細胞，在軟骨形成、代謝以及修復中起著極其重要的作用1. 在骨關節(jié)炎病變過程中軟骨細胞凋亡已被認為是關節(jié)軟骨退行性改變的病理因素之一2-3. 在NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）誘導的軟骨細胞凋亡信號傳導過程中, P38 MAPK信號通路參與了凋亡

5、信號的轉導4. 但目前國內外從信號轉導的角度研究藥物治療骨關節(jié)炎的文獻報道尚少. 復元湯是由曬參、淫羊藿、鹿茸、黃芪、川芎、當歸、枸杞子、三七等組成，是臨床上長期用于治療骨關節(jié)炎并有明顯療效的實驗制劑. 本實驗建立軟骨細胞體外培養(yǎng)體系，觀察復元膠囊含藥血清對SNP誘導的軟骨細胞凋亡的影響，并從信號轉導的角度探討其作用機制.1材料和方法1.1材料雄性3 wk齡清潔級SD大鼠10只，平均體質量（50±5） g；雄性成年普通級SD大鼠20只，平均體質量（220±10） g（由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供）. 復元膠囊由曬參、淫羊藿、鹿茸、黃芪、川芎、當歸、枸杞子、三七等組成，委托

6、重慶希爾安藥業(yè)有限責任公司制成膠囊，僅供實驗使用. SNP粉針劑（批號：H111021635，北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術有限責任公司）；FD（F12DMEM=11）培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清（美國Hyclone公司）；型膠原酶（美國Sigma公司）；胰蛋白酶（美國Gibic公司）；總蛋白提取試劑盒（中國升博生物公司）；P38MAPK抑制劑SB203580（中國上海康成生物公司）；Annexin VFITC試劑盒(中國晶美生物工程有限公司)；Caspase3比色法檢測試劑盒（美國Bio Vision公司）；磷酸化抗體P38(美國cell signaing公司)；P53抗體、蛋白內參actin(美國Santa

7、 Cruz公司)；PBS緩沖液、辣根酶標記兔抗山羊IgG（中國北京中衫生物技術有限公司）；免疫印跡化學發(fā)光試劑（中國碧云天生物公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；SWCJ2A型凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；200113型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海常思工貿有限公司）；CK2型倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；7500型透射電鏡（日本HITACHI公司）；FACS Aria型流式細胞分析儀（美國BD公司）；凝膠成像儀（美國BioRad公司）；ELX800型酶標儀（德國Gene公司）.1.2方法1.2.1軟骨細胞的分離、培養(yǎng)及傳代參照文獻5的方法， 將大鼠斷頸處死后，無菌條

8、件下分離股骨頭，浸入含青霉素和鏈霉素的雙抗水中漂洗3次， FD培養(yǎng)基中漂洗3次；將軟骨剪成1 mm3大小，移入2.5 g/L胰蛋白酶中，37水浴箱中消化30 min；胎牛血清終止消化，PBS緩沖液清洗2遍；再加入2 g/L 型膠原酶，37水浴箱消化，每30 min輕輕搖蕩1次，4 h后消化成絮狀；1000 r/min離心5 min，棄上清，PBS緩沖液清洗2遍；加入含150 mL/L胎牛血清的FD培養(yǎng)基制成細胞懸液，用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾后接種于培養(yǎng)瓶中，置于37,50 mL/L CO2培養(yǎng)箱進行原代培養(yǎng). 倒置顯微鏡下觀察細胞長滿80%后傳代培養(yǎng)，型膠原免疫細胞化學染色鑒定細胞.1.2.2

9、含藥血清的制備雄性成年SD大鼠20只，隨機分為復元膠囊組（10只）和對照組（10只）. 復元膠囊組按MeehRubner氏6公式給予10倍等效劑量藥物，充分溶于生理鹽水后灌胃；對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，每日2次，連續(xù)3 d. 末次灌胃后2 h心臟取血，4靜置過夜，3000 r/min離心20 min，取上清，經0.22 m抽濾除菌后,分裝,-20保存?zhèn)溆?1.2.3實驗分組實驗分為正常組（含150 mL/L胎牛血清的FD培養(yǎng)基正常培養(yǎng)）、模型組（2 mmol/L SNP+FD培養(yǎng)基）、空白血清組（2 mmol/L SNP+含100 mL/L空白血清的FD培養(yǎng)基）、中藥組（2 mmol/L

10、 SNP+含100 mL/L復元膠囊含藥血清的FD培養(yǎng)基）、抑制劑組（2 mmol/L SNP+50 mol/L SB203580+無血清的FD培養(yǎng)基，預先用SB203580孵育1 h，再加入SNP和培養(yǎng)基）、中藥+抑制劑組（2 mmol/L SNP+50 mol/L SB203580+含100 mL/L復元膠囊含藥血清的FD培養(yǎng)基，預先用SB203580孵育1 h，再加入SNP和培養(yǎng)基）.1.2.4透射電鏡形態(tài)觀察將SNP誘導的軟骨細胞用2.5 g/L胰酶消化后進行收集，2000 r/min 4離心成細胞團塊，用25 g/L的戊二醛固定2 h,10 g/L四氧化鋨再固定1.5 h，經梯度丙酮

11、脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片機切片，電子染色，HITACHI7500型透射電鏡下觀察.1.2.5流式細胞分析法檢測細胞凋亡選用第2代軟骨細胞，2×105個/mL密度種植于6孔培養(yǎng)板中. 培養(yǎng)24 h細胞貼壁后，除正常組外，用不含血清的FD培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細胞同步化. 按1.2.3所述進行分組、處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清和胰酶消化的細胞，離心后按FITC AnnexinV/PI試劑盒說明進行操作，采用FACS Aria流式細胞分析儀檢測，每個樣本檢測計數(shù)的細胞數(shù)量均固定為10 000個，應用CEL LQuest軟件獲取、分析輸出實驗數(shù)據(jù).1.2.6比色法檢測Ca

12、spase3活性選用第2代軟骨細胞，2×105個/mL密度種植于6孔培養(yǎng)板中. 培養(yǎng)24 h細胞貼壁后，除正常組外，用不含血清的FD培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細胞同步化. 按1.2.3 所述進行分組、處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h. 參照試劑說明書，分組提取總蛋白，采用Bradford法7測定蛋白濃度. 取50 L含100 g蛋白的細胞裂解上清（如體積不足50 L，用Lysis Buffer補足）置于96孔板中，加入50 L的2×Reaction Buffer，再加入5 L 4 mmol/L的DEVDNA Substrate并于37水浴箱中避光孵育2 h，用ELX800型酶標儀在=4

13、05 nm測定其吸光度值,根據(jù)其A值換算成每微升所含Caspase3的質量. 每組設4個復孔.1.2.7Western Blot檢測磷酸化P38 MAPK激酶、P53蛋白表達選用第2代軟骨細胞，2×105個/mL密度種植于6孔培養(yǎng)板中. 培養(yǎng)24 h細胞貼壁后，除正常組外，用不含血清的FD培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細胞同步化. 按1.2.3所述進行分組、處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h. 參照試劑說明書，分組提取總蛋白，采用Bradford法7測定蛋白濃度. 在BIORAD凝膠成像儀下暴光顯影，觀察拍照. 用Quantity One凝膠圖像分析軟件檢測各組目的蛋白及其內參蛋白的吸光度值，計算兩者

14、的比值，以此作為各組蛋白的相對表達量. 重復4次.統(tǒng)計學處理：統(tǒng)計分析采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理，各組數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較用OneWay ANOVA方差分析，多重比較采用SNKq檢驗.         2結果2.1透射電鏡下軟骨細胞凋亡的形態(tài)學變化凋亡以早期為主，鏡下可見軟骨細胞體積縮小,細胞膜完整，細胞表面的微絨毛明顯減少，甚至消失，細胞漿致密，細胞器完整，核染色質濃縮，集聚于核膜下（圖1A). 也可見中晚期凋亡細胞，細胞體積明顯縮小，核膜發(fā)生皺褶，胞質密度增高,有典型的凋亡小體，內有細胞器

15、,細胞周圍可見脫落的凋亡小體（圖1B）.2.2復元膠囊含藥血清對軟骨細胞凋亡和Caspase3活性的影響與模型組和空白血清組比較，中藥組細胞凋亡率明顯降低，Caspase3活性抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；使用SB203580阻斷P38信號通路后，抑制劑組與模型組比較，凋亡率顯著降低，伴有Caspase3活性抑制（P0.01），而抑制劑與含藥血清合用后，與抑制劑組比較，細胞凋亡率也下降，Caspase3活性抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P0.05，表1）.2.3復元膠囊對軟骨細胞pP38和P53蛋白表達的影響結果如圖2所示，與模型組和空白血清組比較，中藥組能抑制pP38和P53的表達，其差異

16、有顯著統(tǒng)計學意義（P0.01）.SB203580抑制pP38后，pP38表達明顯減少，其下游基因P53表達也減少，與模型組比較，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P0.01）. 當抑制劑與中藥聯(lián)合使用時，與抑制劑組比較，pP38表達無明顯減少（P0.05），而P53表達明顯減少（P0.01，表2）.A： 早期； B： 中晚期.圖1軟骨細胞凋亡形態(tài)TEM ×10 000（略）表1復元膠囊含藥血清對軟骨細胞凋亡和Caspase3活性的影響（略）aP0.05， bP0.01 vs 模型； cP0.05 vs 抑制劑; dP0.01 vs 空白血清.1： 正常組；  2： 模型組； 3： 空

17、白血清組； 4： 中藥組； 5： 抑制劑組； 6： 中藥+抑制劑組.圖2磷酸化P38，P53蛋白的Western Blot檢測結果（略）表2復元膠囊對軟骨細胞pP38和P53蛋白表達的影響（略）aP0.05， bP0.01 vs 模型； cP0.05 vs抑制劑; dP0.01 vs空白血清.3討論復元膠囊具有補益肝腎、益氣活血之功效，可通過調節(jié)軟骨中基質金屬蛋白酶和組織型金屬蛋白酶抑制劑8、白介素1和轉化生長因子29的平衡而減輕兔膝骨關節(jié)炎軟骨的退變. 本實驗從復元膠囊對軟骨細胞凋亡及P38信號轉導通路的角度進一步探討其作用機制.骨關節(jié)炎病變過程中有軟骨細胞凋亡的特征性形態(tài)，細胞凋亡率顯著上

18、升2-3. 本實驗中SNP誘導的軟骨細胞在透射電鏡下可觀察到典型的凋亡形態(tài)，包括細胞體積縮小、染色質凝聚、核碎片、細胞皺縮、凋亡小體等.我們發(fā)現(xiàn)，P38信號轉導通路在SNP誘導的軟骨細胞凋亡過程中激活，其下游基因P53表達同步增加，Caspase3活性增強. 應用復元膠囊含藥血清作用于SNP誘導的軟骨細胞后，磷酸化P38蛋白表達顯著降低，伴隨有P53表達下降和Caspase3活性抑制，同時，細胞凋亡率明顯下降，而空白血清組無明顯變化. 這提示復元膠囊能有效的抑制SNP誘導的軟骨細胞中pP38的表達和活化，進而抑制SNP誘導的軟骨細胞凋亡. 既往研究發(fā)現(xiàn)，P38通過磷酸化IKK（IB的一個上游激

19、酶）和磷酸化P53的絲氨酸15殘基，穩(wěn)定P53蛋白，使其含量增加10. 阻斷P38信號通路后，下游與調節(jié)細胞增殖、細胞凋亡相關的基因如P53,Caspase3,Bax,Bcl2等的表達紊亂，從而對細胞凋亡有抑制作用11. 本實驗結果提示復元膠囊抑制SNP誘導的軟骨細胞凋亡可能的機制是通過抑制pP38的表達和活化，引起其通路下游與細胞凋亡相關基因如P53, Caspase3等的表達或活性降低，進而減少細胞的凋亡.但是，當用P38的特異性抑制劑SB203580阻斷P38信號通路后，軟骨細胞的凋亡率降低. SB203580和復元膠囊含藥血清聯(lián)合使用時，與抑制劑組比較，其凋亡水平下降，P53表達減少，

20、Caspase3活性明顯降低，而pP38表達無明顯變化，表明復元膠囊含藥血清可能還通過其它信號通路如ERK1/2, NFB等抑制SNP誘導的軟骨細胞凋亡，通過幾條通路共同作用或者相互作用，發(fā)揮自身獨特的多靶點效應，還有待進一步研究.【參考文獻】  1 Kronenberg HM. Developmental regulation of the growth plateJ. Nature,2003,423(6937)：332-336.2 Kim HT, Lo MY， Pillarisetty R. Chondrocyte apoptosis following intraarticul

21、ar fracture in humansJ. Osteoarthritis Cartilage， 2002，10(9)：747-749.3 Hashimoto S， Ochs RL， Komiya S， et al. Linkage of chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in human osteoarthritisJ. Arthritis Rheum， 1998，41(9)：1632-1638.4 Kim SJ， Ju JW， Oh CD， et al. ERK1/2 and p38 kinRase oppositely regulate nitric oxideinduced apoptosis of chondrocytes in association with p53, caspase3, and differentiation statusJ. J Biol Chem, 2002, 277(2):1332-1339.5 司徒鎮(zhèn)強，吳軍正. 細胞培養(yǎng)M.西安：世界圖書出版公司，2004：61-81.6 徐叔云. 藥理學實驗方法M. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：203-204.7 Bradford M. A rapid and sensitive meth