果糖-1,6-二磷酸鈣的制備研究

1、果糖-1,6-二磷酸鈣的制備研究摘要首次報(bào)道了一種簡(jiǎn)易，便于工業(yè)生產(chǎn)的分離精制果糖二磷酸鈣(Ca2FDP)的新方法.本法主要改進(jìn)之處是發(fā)酵液先采用調(diào)節(jié)pH生成沉淀步驟除去大量雜質(zhì)，Ca2FDP粗品又經(jīng)酸堿沉淀步驟除去剩余雜質(zhì)；由以上二個(gè)緩和簡(jiǎn)便的固液分離操作，能除去難分離的己糖磷酸酯、磷酸鹽、多糖等雜質(zhì).由本法獲得的Ca2FDP不僅在FDP含量、雜質(zhì)限量等主要質(zhì)量控制指標(biāo)上達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)，而且為制備FDP類(lèi)新衍生物提供了有效手段.關(guān)鍵詞果糖-1,6-二磷酸鈣；制備；精制；質(zhì)量控制A Study on the Preparation of a New Drug Calcium Fructose-1

2、,6-diphosphateWang ChiPan LijunXu Changxi（Department of Biomedical Engineering,Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400016）AbstractA new simple method for isolation and purification of a new drug calcium fructose-1,6-diphosphate from the fermentation mixture and its quality control hav

3、e been reported in this paper.The major contaminating matter,which included inorganic phosphate and hexose monophosphates could be removed by adjusting the pH of the mixture to 8.5.After the crude was recovered,further purification was effected by dissolving the crude in an acid and reprecipitated b

4、y the addition of an alkali,the unknown impurities left were removed by this procedure.The calcium fructose diphosphate in a pure form was obtained.The method is commercially useful in the manufacture of pharmaceuticals.Key wordscalcium fructose-1,6-diphosphate;preparation;purification;quality contr

5、ol果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-diphosphate,FDP,)早在20世紀(jì)30年代就被確認(rèn)為糖代謝的重要中間體.20世紀(jì)80年代以來(lái)，美國(guó)Markov等1經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及臨床研究發(fā)現(xiàn)FDP鈉鹽治療心肌梗死、休克等組織缺血、缺氧性疾病的療效后，由意大利Foscama制藥公司開(kāi)發(fā)的FDP鈉鹽(注射級(jí)凍干粉，商品名為Esafosfina)和果糖二磷酸鈣(calcium fructose-1,6-diphosphate,Ca2FDP,，片劑，商品名為Esafosfina Glutammica)先后于1987年和1992年上市.Esafosfina Glutammica用于腦代謝疾病

6、、骨化疾病、骨骼肌代謝障礙、糖尿病等各種代謝性疾病的輔助治療.有關(guān)FDP鈣鹽制備研究的文獻(xiàn)報(bào)道很少.目前()的工業(yè)生產(chǎn)多采用Leisola2報(bào)道的發(fā)酵法(見(jiàn)1)，發(fā)酵過(guò)程簡(jiǎn)便，但分離精制困難.Fig.1The continuously enzymatic phosphorylationof glucose to FDP()本身是治療藥品，又可以作為研究制備FDP新衍生物的中間體，作者提出在鈣鹽沉淀法前后，采用調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH、沉淀和酸溶堿沉出等分步沉淀的分離精制新方法.該法對(duì)()和()的工業(yè)生產(chǎn)具有簡(jiǎn)便實(shí)用價(jià)值，并為制備()的新衍生物3提供純凈的中間體.()的質(zhì)量以紅外光譜、薄層色譜、含量測(cè)定等

7、質(zhì)量研究進(jìn)行控制.1實(shí)驗(yàn)部分原料：啤酒酵母(S.cerevisiae)由重慶啤酒廠(chǎng)提供，所用菌體均取自生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng).使用時(shí)用蒸餾水洗滌兩次，離心分離，收集菌體.葡萄糖為重慶制藥五廠(chǎng)產(chǎn)品.分析試劑：果糖-1,6-二磷酸三鈉鹽(對(duì)照品)SIGMA；間苯二酚-硫脲試劑：0.1 g間苯二酚和0.25 g硫脲溶于100 mL冰醋酸，貯存于棕色瓶中備用；鉬酸銨試劑：在200 mL水中慢慢加入濃H2SO4 45 mL，再加鉬酸銨22 g，溶解后保存于試劑瓶中備用；對(duì)甲氨基酚硫酸試劑：溶解350 mg對(duì)甲氨基酚硫酸鹽于50 mL水中，加亞硫酸氫鈉20 g，混勻，加水稀釋至100 mL.儀器：SHZ-22型水浴恒溫

8、振蕩器(江蘇太倉(cāng)縣醫(yī)療器械廠(chǎng))；CS 501型超級(jí)恒溫器(重慶試驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng))；721型分光光度計(jì)(四川分析儀器廠(chǎng))；IR-440型紅外光譜儀(日本島津).1.1制備方法發(fā)酵：參照Leisola等2的方法，發(fā)酵液組成中，原料改用葡萄糖代替蔗糖，NaH2PO4，MgCl2.調(diào)節(jié)pH 6.5左右，加入新鮮啤酒酵母和甲苯后，混勻，密閉，在30下進(jìn)行恒溫振搖，反應(yīng)35 h，反應(yīng)終點(diǎn)由快速分析發(fā)酵液中無(wú)機(jī)磷含量下降至最低點(diǎn)法確定.分離、精制：發(fā)酵畢，離心，棄去酵母，用三氯醋酸沉淀除去蛋白質(zhì)后，離心，取上清液加入氨水調(diào)節(jié)pH 8.5，有大量沉淀生成.待沉淀畢，離心棄去沉淀，再加入約200 mL 50CaCl2

9、溶液，即可得()的粗制品.粗制品于100 mL蒸餾水中，緩慢滴加鹽酸溶液至pH 1.0，離心，棄去不溶物.上清液中加入NaOH溶液至pH 8.5，離心，收集沉淀.重復(fù)操作一次.減壓過(guò)濾，收集沉淀于真空干燥器中，干燥后得到白色粉末()35 g.按發(fā)酵液(2L)中FDP濃度計(jì)算，收率約為50.1.2主要質(zhì)量指標(biāo)分析測(cè)試紅外光譜：供試品用溴化鉀壓片，對(duì)照品同樣處理.在島津IR-440型紅外儀上測(cè)定紅外吸收光譜.薄層色譜參照文獻(xiàn)4方法進(jìn)行測(cè)定.FDP的測(cè)定：參照文獻(xiàn)5方法，精密稱(chēng)取適量(約0.15 g)供試品，溶于蒸餾水中(若樣品不溶可加幾滴鹽酸)，稀釋至100 mL，吸取10 mL再稀釋至100 m

10、L，吸取2 mL溶液以酚酞為指示劑加NaOH溶液至紅色出現(xiàn)，加4滴25醋酸鋇溶液，放置15 min，離心，沉淀用5 mL 75乙醇洗滌，離心，洗液棄去，向沉淀中加入預(yù)先混合并冷卻的顯色試劑(7 mL濃鹽酸，2 mL間苯二酚-硫脲試劑和1 mL蒸餾水)，攪拌，離心.將上清液置于80水浴中加熱13 min，冷至室溫后，用721分光光度計(jì)在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.以D-果糖二磷酸三鈉鹽(SIGMA)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).據(jù)供試品吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求出含量.無(wú)機(jī)磷酸鹽(Pi)的測(cè)定：精密稱(chēng)取約20 mg供試品，按照中華人民共和國(guó)藥典1995年版二部地塞米松磷酸鈉中游離磷酸項(xiàng)測(cè)定.Ca2+的測(cè)定采用EDT

11、A法.2結(jié)果 紅外光譜測(cè)定結(jié)果：果糖-1,6-二磷酸鈣具有單糖的酯類(lèi)結(jié)構(gòu)，分子中羥基較多，故特征峰為OH鍵的伸縮振動(dòng)(OH)和碳氧鍵的伸縮振動(dòng)(CO)以及糖與磷酸基相連的COP鍵的伸縮振動(dòng)(COP)，結(jié)果見(jiàn)表1.由上述分析可知，樣品與對(duì)照品在相同測(cè)試條件下錄制的紅外吸收光譜及解析結(jié)果基本一致.證明了供試品No.5中果糖二磷酸的結(jié)構(gòu).薄層色譜法檢測(cè)結(jié)果：供試品與SIGMA公司的果糖二磷酸三鈉對(duì)照品的Rf值及斑點(diǎn)顏色一致.幾種分離精制法比較：直接鈣鹽沉淀法2與分步沉淀分離法各步驟對(duì)()的主要質(zhì)量指標(biāo)(FDP含量，雜質(zhì)Pi限量)的影響見(jiàn)表2.Tab.1Infrared spectral analys

12、isReference standardSample(No.5)Wave number/cm-1Absorption peakWave number/cm-1Absorption peak34003200OH36003300OH16601630CO16601620CO10801030CO10801040CO940920COP940920COPTab.2The comparision of quality of Ca2FDPNo.PrecipitationFDP/Pi/Ca2+/Calcd.FoundLimitFoundCalcd.Found1simple80.9542.212519.05202

13、adjusted pH80.9548.2020.8619.0518.223acid and alkali80.9569.4424.1619.0518.664No.2+No.380.9576.6620.6719.0518.755No.2+No.380.9576.6020.4019.0518.49Calculated on the anhydrous basis 3討論FDP的化學(xué)性質(zhì)活潑，對(duì)酸、堿、加熱都很敏感.酸性介質(zhì)中，F(xiàn)DP C1高能磷酸鍵易水解.在堿性介質(zhì)中，F(xiàn)DP易發(fā)生異構(gòu)化.細(xì)菌污染后則降解為三碳糖磷酸酯.文獻(xiàn)中()的前體()從發(fā)酵液中提取，分離精制的方法主要有下述幾種：Sable等

14、6報(bào)道將()經(jīng)FDP鋇鹽，再轉(zhuǎn)化成士的寧鹽，通過(guò)重結(jié)晶純化FDP.其步驟冗繁且士的寧劇毒、價(jià)昂，無(wú)藥用生產(chǎn)價(jià)值.Leisola2曾用鈣鹽直接沉淀法和反滲析法，并指出這一純化過(guò)程不能去掉Pi，反滲析過(guò)程中FDP量有0%50的損失.意大利Foscama專(zhuān)利法7是在發(fā)酵液去蛋白質(zhì)后，經(jīng)陽(yáng)離子樹(shù)脂除去陽(yáng)離子，陰離子樹(shù)脂吸附FDP陰離子，再用NH4Cl/NH3，NaCl和HCl溶液洗脫，洗脫液中和后凍干制取().此法樹(shù)脂用量大，吸附、洗脫、大量稀釋后濃縮過(guò)程周期長(zhǎng)，易導(dǎo)致細(xì)菌性污染降解，設(shè)備昂貴，生產(chǎn)成本高.表2中鈣鹽直接沉淀法(No.1)為參照Leisola2等方法所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，產(chǎn)品中FDP含量最低，

15、而雜質(zhì)Pi最高,Ca2+也高,其中含雜質(zhì)Ca2+.與藥用級(jí)標(biāo)準(zhǔn)FDP含量(按水合物計(jì))75,Pi2的要求差距較大.表2所列本文提出的分步沉淀分離法中，分別觀察僅單獨(dú)使用一項(xiàng)分離步驟及綜合使用兩項(xiàng)步驟的結(jié)果有顯著差別.將發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH至沉淀產(chǎn)生(No.2),在大幅度減低Pi雜質(zhì)的同時(shí),提高FDP含量；單獨(dú)用酸堿沉淀(No.3)，F(xiàn)DP含量明顯提高,但Pi雜質(zhì)仍較高；綜合使用兩步驟(No.4，No.5)所獲得的產(chǎn)品中FDP含量和Pi雜質(zhì)兩項(xiàng)指標(biāo)均獲得滿(mǎn)意的結(jié)果.Ca2FDP總含量為95.41,95.09，Pi雜質(zhì)限量均優(yōu)于文獻(xiàn)2報(bào)道.此外No.1，No.2產(chǎn)品在干燥器中干燥顯淡黃色，50加熱干燥變

16、深黃色，而No.4，No.5產(chǎn)品顏色潔白，80加熱干燥、留樣觀察一年組成穩(wěn)定，亦不變色.應(yīng)用精制()作為中間體制備新衍生物能獲得滿(mǎn)意的結(jié)果.王馳（重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究室，重慶 400016）潘黎軍（重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究室，重慶 400016）徐昌喜（重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究室，重慶 400016）參考文獻(xiàn)1，Markov AK.Hemodynamics and metabolic effects of fructose-1,6 - diphosphate in ischemia and shock-experimental and clinical observations

17、.Annals of Emergency Medicine,1986,12(15):1431502，Leisola M,Linko M.Preparation and purification of fructose -1,6-diphosphate.Acta Chemica Scandinavica B,1974,28(5):5555583，王馳,徐昌喜,周遠(yuǎn)大，等.D-果糖-1,6-二磷酸鈉鎂的制備方法及其用途.中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局,發(fā)明專(zhuān)利公報(bào),1999,第15卷,第12號(hào)4，陳心善,劉云.薄層色譜法檢測(cè)果糖二磷酸和游離磷酸鹽的研究.藥物分析雜志,1996,16(5):3033055，Roe JH.The determ