2014《藥理學(xué)》實驗

1、藥理學(xué)實驗講義實驗一 藥理學(xué)實驗的基本知識和基本技術(shù)一、目的1. 掌握基本操作，鍛煉動手、動腦能力；2. 更好地掌握藥理學(xué)基本理論知識；3. 培養(yǎng)科學(xué)思維二、基本要求1. 實驗前：預(yù)習(xí)實驗內(nèi)容并復(fù)習(xí)相關(guān)理論知識；2. 實驗時 實驗器材要妥善保管； 實驗操作按步驟進(jìn)行，仔細(xì)觀察實驗中出現(xiàn)的現(xiàn)象，實事求是地做好記錄； 注意節(jié)約實驗藥品； 維持良好的課堂紀(jì)律。3. 實驗后 各組同學(xué)將實驗動物處死，實驗臺擦干凈，將實驗方盤送回準(zhǔn)備室； 值日生搞好實驗室衛(wèi)生，將死亡動物送至指定場所； 書寫實驗報告。三、實驗報告的書寫1.題目2.目的3.原理4.材料：實驗動物，器材，藥品5.方法：用自己的語言簡單扼要描述

2、出來；6.結(jié)果：要求真實、清楚；7.討論：將實驗結(jié)果進(jìn)行比較、分析；實驗中有哪些不足之處；結(jié)果異?；蚴〉脑?；8. 結(jié)論：將實驗結(jié)果進(jìn)行歸納總結(jié)，應(yīng)帶有提示性質(zhì)。四、藥理學(xué)實驗實驗設(shè)計原則1. 隨機(jī)原則 按照機(jī)遇均等的原則進(jìn)行分組。其目的是使一切干擾因素造成的實驗誤差減少， 而不受實驗者主觀因素或其他偏性誤差的影響。2. 對照原則空白對照（指在不加任何處理的條件下進(jìn)行觀察對照） ；陰性對照也稱假處理對 照（給予生理鹽水或不含藥物的溶媒）；陽性對照也稱標(biāo)準(zhǔn)對照（指以已知經(jīng)典 藥物在標(biāo)準(zhǔn)條件下與實驗藥進(jìn)行對照）。3. 重復(fù)原則能在類似的條件下， 把實驗結(jié)果重復(fù)出來， 才能算是可靠的實驗， 重復(fù)實

3、驗除增 加可靠性外，也可以了解實驗變異情況。五、實驗動物1. 動物的選擇（1）小白鼠：適用于需大量動物的實驗，如某些藥物的篩選，半數(shù)致死量的 測定。也較適用于避孕藥實驗、抗炎鎮(zhèn)痛藥實驗、中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥實驗、抗腫瘤 藥及抗衰老藥實驗等。（2）大白鼠：比較適用于抗炎藥物實驗，血壓測定、利膽、利尿藥實驗，也可 用于進(jìn)行亞急性和慢性毒性實驗。（3）豚鼠：因其對組胺敏感，并易于致敏，故常被選用于抗過敏藥、平喘藥 和抗組胺藥的實驗。也常用于離體心臟、心房、腸管實驗。又因它對結(jié)核敏感， 常用于抗結(jié)核病藥的實驗。（4）家兔：常用于觀察研究腦電生理作用，藥物對小腸的作用。由于家兔體溫 變化敏感，也常用于體溫實驗

4、，用于熱原檢查。（5）狗：狗是記錄血壓，呼吸最常用的大動物。還可利用狗做成胃瘺、腸瘺， 以觀察藥物對胃腸蠕動和分泌的影響。在進(jìn)行慢性毒性實驗時，也常采用狗。2. 實驗動物的編號 狗、兔等較大的動物可用特制的鋁質(zhì)號碼牌固定在頸部或耳上。 大鼠、小鼠如為 白色可用黃色苦味酸在不同的體表標(biāo)志上標(biāo)記。3. 動物固定及給藥（1）小鼠捉拿 小鼠性情較溫順，一般不會咬人，比較容易抓取固定。通常用右手提起小 鼠尾巴將其放在鼠籠蓋或其它粗糙表面上， 在小鼠向前掙扎爬行時， 用左手拇指 和食指捏住其雙耳及頸部皮膚， 將小鼠置于左手掌心、 無名指和小指夾其背部皮 膚和尾部，即可將小鼠完全固定。在一些特殊的實驗中，如

5、進(jìn)行尾靜脈注射時， 可使用特殊的固定裝置進(jìn)行固定， 如尾靜脈注射架或?qū)Ｓ眯∈蠊潭ㄍ病?如要進(jìn)行 手術(shù)或心臟采血應(yīng)先行麻醉再操作， 如進(jìn)行解剖實驗則必須先行無痛處死后再進(jìn) 行。（2）小鼠灌胃 用左手固定鼠，右手持灌胃器，將灌胃針從鼠的口腔插入，壓迫鼠的頭部， 使口腔與食道成一直線 , 將灌胃針沿咽后壁慢慢插入食道，可感到輕微的阻力 , 此時可略改變一下灌胃針方向， 以刺激引起吞咽動作， 順勢將藥液注入。 一般灌 胃針插入小鼠深度為34cm大鼠或豚鼠為46cm。常用灌胃量小鼠為0.21ml, 大鼠14ml,豚鼠15ml。（ 3）小鼠腹腔注射先將動物固定 , 腹部用酒精棉球擦試消毒，然后在左或右側(cè)腹

6、部將針頭刺入 皮下，沿皮下向前推進(jìn)約 0.5 厘米，再使針頭與皮膚呈 45 度角方向穿過腹肌刺 入腹腔，此時有落空感，回抽無腸液、尿液后，緩緩?fù)迫胨幰?。此法大小鼠用?較多。（4）皮下注射 注射時用左手拇指及食指輕輕捏起皮膚，右手持注射器將針頭刺入 , 固定后 即可進(jìn)行注射。 一般小鼠在背部或前肢腋下， 大鼠在背部或側(cè)下腹部； 豚鼠在后 大腿內(nèi)側(cè)、 背部等脂肪少的部位； 兔在背部或耳根部注射； 蛙可在脊背部淋巴囊 注射；狗多在大腿外側(cè)注射，拔針時，輕按針孔片刻，防藥液逸（ 5）家兔捉拿右手握住兔頸背部皮膚輕輕提起， 再以左手托起其臂部， 使兔呈坐位姿勢。（6）家兔耳緣靜脈注射采用外耳緣靜脈，因

7、其表淺易固定。注射部位除毛，用 75的酒精消毒，手 指輕彈兔耳，使靜脈充盈， 左手食指和中指夾住靜脈的近心端， 拇指繃緊靜脈的 遠(yuǎn)心端，無名指及小指墊在下面，右手持注射器，盡量從靜脈的遠(yuǎn)端刺入血管， 移動拇指于針頭上以固定，放開食、中指，將藥液注入，然后拔出針頭，用手壓 迫針眼片刻以止血。實驗二 影響藥物效應(yīng)的因素（給藥途徑）目的觀察藥物從不同途徑引入機(jī)體可能產(chǎn)生不同的作用；觀察不同給 藥途徑對藥物作用速度、強(qiáng)度的影響。原理肌肉注射或靜脈注射對中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制、解痙。鎂離子抑制運動神經(jīng) 末梢對乙酰膽堿的釋放，阻斷神經(jīng)和肌肉傳導(dǎo)，使骨骼肌松弛，故能有效地預(yù)防 和控制抽搐（子癇），但是注射過量鎂離

8、子會鎂因會與鈣發(fā)生拮抗作用導(dǎo)致乙酰 膽堿與鈣離子的偶聯(lián)作用減弱，使心肌細(xì)胞興奮性減弱，從而腦供血不足，而死 亡；口服難以吸收，使腸腔內(nèi)滲透壓升高，大量水分使腸道擴(kuò)張，使腸壁感受 器受到刺激，導(dǎo)致腹瀉；器械1ml注射器2支，小白鼠胃管一支,。藥物飽和硫酸鎂溶液（飽和度為1000ml,水中溶解440g硫酸鎂）。動物小白鼠2只。方法取體重大小相似的小白鼠兩只，稱好體重，按下面兩種途徑給藥，觀察并記 錄。 按每10g體重0.2ml作肌肉注射飽和硫酸鎂, 用同樣劑量灌胃。結(jié)果記錄：將實驗結(jié)果填入下表。表1:硫酸鎂作用結(jié)果鼠 號藥物劑量給藥途徑反 應(yīng)1飽和硫酸鎂0.2ml/10g體重肌注2灌胃思考題同一種

9、藥物以不同途徑給藥時為什么會影響藥物效應(yīng)?實驗三藥物的鎮(zhèn)痛作用一、目的：了解熱板法的實驗原理，觀察阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用。二、原理：小鼠的足底無毛，皮膚裸露，在溫度55±0.5 C的金屬板上產(chǎn)生疼痛反應(yīng)，表現(xiàn) 為舔后足，踢后腿等現(xiàn)象。鎮(zhèn)痛藥可提高痛閾，推遲小鼠疼痛出現(xiàn)時間。三、材料：雌性小鼠2只、熱板儀、0.4%乙酰水楊酸溶液、生理鹽水、四、方法：1. 準(zhǔn)備工作調(diào)定熱板儀溫度使之恒定于55 ± 0.5 oCo2. 小鼠的選擇及正常痛閾的測定取小鼠數(shù)只，依次熱板儀上，按“開始”鍵記錄時間。自放入熱板儀至出 現(xiàn)舔后足所需的時間（秒）作為該鼠的痛閾值。凡在30秒內(nèi)不舔足或逃避者棄置

10、不用。取篩選合格的小鼠3只，各鼠編號后重復(fù)測其正常痛閾值一次，將所測兩 次正常痛閾平均值作為該鼠給藥前痛閾值。3. 給藥及給藥后痛閾值測定各組的動物注射下列藥品0.1ml/kg，并記錄給藥時間。一只用0.4%乙酰水楊酸溶液（400mg/kg）;另一只，用生理鹽水。給藥后10min、30min后各測小鼠痛閾值1次。60秒仍無反應(yīng)，應(yīng)將小鼠取出, 痛閾值以60秒計。4. 實驗完畢后，收集全實驗室數(shù)據(jù)按下列公式計算不同時間的各鼠痛閾提高百分 率：痛閾提高百分率（）x 100%給藥后平均痛閾值-給藥前平均痛閾值 給藥前平均痛閾值5. 以時間（min）為橫坐標(biāo)，痛閾提高百分率為縱坐標(biāo)，繪制各組的時-效曲

11、線【注意事項】1本實驗應(yīng)選用雌性小鼠，雄性小鼠遇熱時陰囊松弛下垂，與熱板接觸影響實驗 結(jié)果。2室溫應(yīng)控制在13± 18C，此溫度小鼠對痛反應(yīng)較穩(wěn)定。3正常痛閾30s、W 10s以及喜跳躍的小鼠均應(yīng)棄用。4測痛閾時若60s仍無反應(yīng)，應(yīng)立即取出小鼠，以免燙傷足趾，且痛閾按 60s計實驗四 藥物對小鼠自發(fā)活動的影響、目的:觀察藥物對小鼠自發(fā)活動的影響，以分析藥物作用表現(xiàn)為興奮作用還是抑制 作用。二、原理：自發(fā)活動是正常動物的生理特征。自發(fā)活動的多少往往能反映中樞興奮或抑 制作用狀態(tài)。鎮(zhèn)靜催眠藥均可明顯減少小鼠的自發(fā)活動。小鼠自發(fā)活動減少的程度與鎮(zhèn)靜催眠藥作用強(qiáng)度成正比。三、材料： 小鼠2只

12、小鼠自主活動記錄儀、注射器（1mix 2）、天平、4%水合氯醛溶液。四、方法：取小鼠2只，稱體重，分別進(jìn)行腹腔注射，對照組一只注射生理鹽水，另一只注射 4%水合氯醛溶液10ml/kg。給藥30mi n后將各組小鼠分別放人自主活動箱中，每隔 5mi n記錄1次各組小 鼠活動數(shù)。連續(xù)觀察到20min比較給藥組與對照組小鼠活動數(shù)，用公式計算各給 藥組小鼠20min累計自發(fā)活動抑制率：對照組小鼠自發(fā)活動數(shù)-給藥組小鼠自發(fā)活動數(shù)自發(fā)活動抑制率=X 100%對照組小鼠自發(fā)活動數(shù)【注意事項】1小鼠應(yīng)盡量選取活潑者，同性。2實驗前禁食禁水24h。3實驗最好在20E以上室溫下進(jìn)行，室溫過低常影響小白鼠活動4.

13、實驗最好在上午做，以為小鼠的活動通常在中午及下午減少。實驗五 藥物半數(shù)致死量（ LD50 ）的測定一、實驗?zāi)康暮驮碚莆账幬锇霐?shù)致死量（ LD50 ）的測定方法；掌握簡化機(jī)率單位法的計算方 法；了解急性毒性實驗的相關(guān)內(nèi)容及新藥安全性評價的內(nèi)容。藥物的急性毒性常以 LD50 來表示，即能夠引起試驗動物 半死亡的劑量。 在實驗設(shè)計合理并嚴(yán)格掌握實驗技術(shù)的條件下， 藥物致死量的對數(shù)大多在半數(shù)致 死量的上下形成常態(tài)分布。通過計算可求出 LD50 。本實驗了解藥物（以水合氯醛為例）引起一半動物死亡的藥物劑量 （median lethal dose, LD50） 的測定方法和計算過程。二、實驗方法（一）探

14、索劑量范圍取小鼠912只，以3只為一組，分成34組，包括組距較大的一系列劑量， 按組分別灌胃水合氯醛溶液， 觀察出現(xiàn)的癥狀并記錄死亡數(shù)， 找出引起0及1 00 死亡率劑量的所在范圍，此即上下限劑量 Dm及 Dn ）。（二）確定組數(shù)并計算各組劑量1. 確定組數(shù)（G）:可根據(jù)適宜的組距確定組數(shù)，一般用58個劑量組，按 等比級數(shù)增減。2. 計算各組劑量：在找出Dm、Dn和確定組數(shù)后，可按下列公式求出公比r（r = lg-1 （IgDm-IgDn） / （G-l ），再按公比計算各組劑量 D1Dm其中D仁Dn= 最小劑量。3. 配制等比稀釋藥液系列，使每只小鼠給藥容量相等，一般為 0.l0.25ml

15、/10 g 體重。（三）進(jìn)行正式實驗在預(yù)實驗所獲得的 0%和100致死量范圍內(nèi)，選用幾個劑量，盡可能使半數(shù) 組的死亡率都在 50以上，另半數(shù)組的死亡率都在 50以下。各組動物的只數(shù)應(yīng) 相等或相差無幾， 每組10只左右， 動物的體重和性別要均勻分配。 完成動物分組 和劑量計算后， 按組腹腔注射給藥。 最好先從中劑量組開始， 以便能從最初幾組 動物接受藥物后的反應(yīng)來判斷兩端的劑量是否合適，否則可隨時進(jìn)行調(diào)整。（四）統(tǒng)計實驗結(jié)果給藥后經(jīng)一定時間， 清點各組的死亡小鼠數(shù)。 用改良寇氏法計算藥物的 LD50。 公式為 LD50=Ig-1IgDm - lgr（刀 P- 0.5）四、實驗結(jié)果 要點：實驗日期

16、、檢品的批號、規(guī)格、廠名、理化性狀、溶液的濃度、實驗 時室溫、 小鼠的性別、 體重、給藥途徑、 劑量（藥物的絕對量與溶液的容時量） 、 給藥時間、中毒癥狀、死亡時間、死亡率和 LD50的計算過程。結(jié)果記錄如下表?！咀⒁狻?、預(yù)試驗要摸準(zhǔn)藥物引起 0 和 100%死亡率劑量的所在范圍。2、 正式試驗時各劑量按等比級數(shù)分組，應(yīng)避免最大劑量組的死亡小于80% 最小劑量組死亡率大于20%否則改用其他方法計算。3、室溫：20C為宜。4、認(rèn)真觀察中毒癥狀情況。附：改良寇氏法組別藥物濃度濃度對數(shù)值動物數(shù)死亡動物數(shù)死亡率P1DmleDin23456EPLD50=lo£1Ah>? < LP

17、-0.5）（公式 1）Ahi：堪大劑量組劑量對數(shù)值I：相鄰兩組劑量高劑量與低劑量之比的對數(shù)（相鄰兩組對數(shù)劑量的差值）P：務(wù)組動物死亡率，用小數(shù)表示如果死亡率為80%應(yīng)寫成0.80）ZP：各組動物死亡率之總和n：毎紐動物數(shù)50= i X 軀卩-工"）心-1）（公式2）S燦:logLD>o的標(biāo)R.L戻為冃ogLD兄LD劉的95%可信PH=logl 氐±1.9礙和）（公式3）LD兀的平均可信限的巧可信限的高限低限）/2 （公武4）注附：根據(jù)資料5個參考劑量為618.75 mg/kg825 mg/kg1100 mg/kg1375 mg/kg1718.75 mg/kg新藥篩選的

18、動物模型的建立一、目的：學(xué)習(xí)實驗動物模型的概念。學(xué)會建立幾種常見病的動物模型。二、實驗原理動物模型的概念科學(xué)研究是探索未知，實驗研究的結(jié)果往往會出乎意外，不受人為的控制， 所以關(guān)乎人類本身的研究， 在人體上進(jìn)行試驗， 風(fēng)險很大； 對一些數(shù)量很少的珍 稀動物，或一些因體型龐大，不易實施操作的種類，往往用取材容易，操作簡便 的另一種動物來進(jìn)行實驗研究，代替人類或原來的目標(biāo)動物，這就是動物實驗。 為了保證這些動物實驗更科學(xué)、 準(zhǔn)確和重復(fù)性好， 用各種方法把一些需要研究的 生理或病理活動相對穩(wěn)定地顯現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)化的實驗動物身上， 供實驗研究之用。 這 就稱之為動物實驗中的動物模型動物模型在生物醫(yī)學(xué)中的意義

19、。1. 可復(fù)制 臨床上一些疾病不常見 , 如放射病、毒氣中毒、烈性傳染病、 外 傷、腫瘤等。還有一些如遺傳性、免疫性、代謝性和內(nèi)分泌、血液等疾病，發(fā)生 發(fā)展緩慢、潛伏期長，病程也長，可能幾年或幾十年 , 在人體很難進(jìn)行 3世代以上 的連續(xù)觀察。 人們可有意選用動物種群中發(fā)病率高的動物， 通過不同手段復(fù)制出 各種模型， 在人為設(shè)計的實驗條件下反復(fù)觀察和研究， 甚至可進(jìn)行幾十世代的觀 察，同時也避免了人體實驗造成的傷害。2. 可按需要取樣 動物模型作為人類疾病的 “復(fù)制品 ”, 可按研究者的需要 隨時采集各種樣品或分批處死動物收集標(biāo)本， 以了解疾病全過程， 這是臨床難以 辦到的。3. 可比性 一般

20、疾病多為零散發(fā)生 ,在同一時期內(nèi) ,很難獲得一定數(shù)量的定 性材料, 而模型動物不僅在群體數(shù)量上容易得到滿足，而且可以在方法學(xué)上嚴(yán)格 控制實驗條件，在對飼養(yǎng)條件及遺傳、微生物、營養(yǎng)等因素嚴(yán)格控制的情況下， 通過物理、 化學(xué)或生物因素的作用， 限制實驗的可變因子， 并排除研究過程中其 它因素的影響， 取得條件一致的、 數(shù)量較大的模型材料， 從而提高實驗結(jié)果的可 比性和重復(fù)性，使所得到的成果更準(zhǔn)確更深入。4. 有助于全面認(rèn)識疾病的本質(zhì) 在臨床上研究疾病的本質(zhì)難免帶有一定局 限性。許多病原體除人以外也能引起多種動物的感染， 其癥狀體征表現(xiàn)可能不完 全相同。但是通過對人畜共患病的比較， 則可以充分認(rèn)識同

21、一病原體給不同機(jī)體 帶來的各種危害，使研究工作上升到立體的水平來揭示某種疾病的本質(zhì)。三、方法：實驗六 抗胃動力不足藥物的動物篩選模型基本原理 胃具有收納食物 ,對之進(jìn)行消化、勻合、研磨,形成食糜 .節(jié)奏性的送入小腸的 作用,它們與底部胃壁的順應(yīng)性擴(kuò)張，胃體與胃竇部節(jié)律性收縮以及幽門括約肌 的規(guī)律性開放閉闔等有關(guān)。當(dāng)食糜入腸后 ,在食糜的機(jī)械性以及化學(xué)性刺激下， 通過體液及神經(jīng)機(jī)制促使膽汁及胰液排入十二指腸 ,加入腸管的運動進(jìn)行消化， 吸收及傳輸。消化系統(tǒng)的癥狀 ,諸如燒心、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉以及由此由 此派生的水、 電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂乃至某些營養(yǎng)不良， 其發(fā)病原因在一定程度 上都與胃腸道

22、及 /或胰膽管的運動失常有關(guān)；又由于消化道具有與外界相通，可 以直接接觸的特點 ,因而也就為消化系統(tǒng)的實驗室和臨床藥理學(xué)研究 ,提供了有利 的條件。在消化系統(tǒng)的癥狀中，胃動力不足、胃阻滯是常見的一種。而阿托品為阻 斷 M 膽堿受體的抗膽堿藥， 其能降低胃平滑肌蠕動的幅度和頻率， 因此常用于胃 動力不足動物模型的建立實驗對象 小鼠3只（ 18-22g）。實驗試劑與器材 1. 器材 小鼠灌胃器、眼科剪、眼科鑷、 1mL 注射器、放大鏡、電子天平、濾 紙。2. 試劑和藥品 嗎丁啉、硫酸阿托品、生理鹽水操作步驟 取健康昆明種小鼠 3只，分為空白對照組，模型組，嗎丁啉組?？瞻讓φ談e灌胃0.2ml/10g

23、的生理鹽水，30min后，脫頸椎處死小鼠，打開腹 腔，結(jié)扎幽門和賁門，取出胃。模型組與嗎丁啉組小鼠腹腔注射硫酸阿托品 2mg/kg，給藥后30mi n后，模 型組灌胃0.2ml/10g的生理鹽水，嗎丁啉組灌胃12mg/kg的嗎丁啉，給藥后30min 后，脫頸椎處死小鼠，打開腹腔，結(jié)扎幽門和賁門，取出胃各取出的胃用濾紙擦干后稱全重，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物 后擦干，觀察胃形態(tài)， 稱凈重。以全重與凈重之差為指標(biāo)比較三組的胃排空能力。 綜合全班數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗七 實驗性胃潰瘍模型的建立與防治實驗?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)小鼠胃潰瘍模型建立的方法。2觀察藥物對實驗性胃潰瘍的防治作用。實驗原理 消化性潰瘍(peptic ulcer)是由多種因素引起的一種常見病。正常情況下，機(jī) 體有胃黏液、胃黏膜屏障(mucosal barrier)、黏膜細(xì)胞更新以及胃、十二指腸 節(jié)律性運動功能等一系列保護(hù)性機(jī)理， 使胃、 腸黏膜不受損傷。 但過度的精神緊 張、情緒激動，會使神經(jīng)系統(tǒng)