2葉綠體分離、離體葉綠體還原活性

1、實(shí)驗(yàn)五 葉綠體的分離、離體葉綠體的還原活性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹苽渚哂谢钚缘碾x體葉綠體和測定希爾反應(yīng)活力是研究葉綠體結(jié)構(gòu)功能和光合作用機(jī) 理的重要技術(shù)條件。本實(shí)驗(yàn)通過學(xué)習(xí)分離制備葉綠體的技術(shù)方法，加深對希爾反應(yīng)的理解及對光反應(yīng)的認(rèn) 識。二、實(shí)驗(yàn)原理光合作用機(jī)制是一個比較復(fù)雜的問題，可分為光反應(yīng)和暗反應(yīng)，大致分為三大步驟：<1 ）原初反應(yīng) <光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換過程）；<2 ）電子傳遞和光合磷酸化 < 電能轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S的化學(xué)能）；<3）碳同化 <活躍的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的化學(xué)能）。光反應(yīng)中，由水至 NADP+的電子傳遞是由兩個反應(yīng)中心PSH和PSI經(jīng)過兩種連續(xù)光化學(xué)反應(yīng)

2、驅(qū)動的，psn的一個重要功能是利用光能使水裂解放氧。光子-+-2H * O2+ 4H + 4e英國生物化學(xué)家Hill<1937 ）首先將離體葉綠體加入有適當(dāng)氫受體<如草酸高鐵鉀鹽，2,6-二氯酚靛酚，NAD+和NADP+）的水溶液中，照光后即有 。2放出，這就是水的光解，即 希爾反應(yīng)。葉綠體的分離采用離心分級分離，即利用葉綠體的直徑和沉降系數(shù)與其他細(xì)胞器不同 的特點(diǎn)，先用低速離心除去細(xì)胞碎片，后用高速離心沉降葉綠體。希爾反應(yīng)活力的測定是 將葉綠體加入氫受體，并照光，水被光解放氧，溶液顏色發(fā)生變化，通過比色測定。三、實(shí)驗(yàn)材料新鮮菠菜葉片。四、設(shè)備與試劑分光光度計，離心機(jī)，照光裝置 &

3、lt;2只500W鎢燈作為光源），試管，移液管，燒杯， 紗布，研缽等。0.35MNaCI 溶液、O.OIMTris 溶液五、實(shí)驗(yàn)步驟1、離體葉綠體的制備：稱鮮菠菜葉5g,加10ml0.35M NaCl、1ml Tris緩沖液、石英砂，研磨。勻漿用脫脂棉過濾。1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清液，3000轉(zhuǎn)份離心5分鐘。去除上清液，保留沉淀。在沉淀中加入5mlO.35MNaCI，攪勻，得到葉綠體懸浮液。2、希爾反應(yīng)活力的測定按照下面表格，取三支試管，分別進(jìn)行不同的操作。將三支試管中的溶液倒入對應(yīng)的比色杯中，以3號試管調(diào)零，620nm處比色。然后將比色杯置于光源 60cm處照光。表1口呂號0.1ml

4、Tris緩沖液葉綠體2.6-二氯吲哚叮酚19.3ml0.2ml0.5ml29.3ml0.2ml5min0.5ml39.8ml0.2ml六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2口呂號光值1光值2光值3光值4光值5123將所測光值記錄到上表，畫出曲線圖，并分析原因。七、注意事項1、2.6-二氯吲哚叮酚必須在煮沸加熱后滴加。2、溶液加入比色杯就開始計時。3、每次測光時都應(yīng)調(diào)零和百分比。4、試管加熱時管口不要對準(zhǔn)他人。八、思考題1. 試管中藍(lán)色褪去的原因是什么 ？與光照有什么關(guān)系？2 煮沸對葉綠體有何影響？3 請對結(jié)果作出解釋。附錄1：離心機(jī)的構(gòu)造及使用離心機(jī)是利用離心力對混合液 含有固形物）進(jìn)行分離和沉淀的一種專用儀器。實(shí)

5、驗(yàn) 室常用電動低速離心機(jī)、高速離心機(jī)和低速、高速冷凍離心機(jī)，以及超速分析、制備兩用 冷凍離心機(jī)等多種型號。其中以低速包括大容量）離心機(jī)和高速冷凍離心機(jī)應(yīng)用最為廣泛，是生化實(shí)驗(yàn)室用來分離制備生物大分子必不可少的重要工具。在實(shí)驗(yàn)過程中，欲使沉淀與母液分開，常使用過濾和離心兩種方法。在下述情況下，使用離心方法效果較好。沉淀有粘性或母液粘稠。沉淀顆粒小，容易透過濾紙。沉淀量過多而疏松。沉淀量很少，需要定量測定。或母液量很少，分離時應(yīng)減少損失。沉淀和母液必須迅速分開。一般膠體溶液。電動低速離心機(jī)的基本結(jié)構(gòu)和性能低速離心機(jī)結(jié)構(gòu)較簡單，可分小型臺式和落地式兩類，配有驅(qū)動電機(jī)、調(diào)速器、定時器等裝置，操作方便。

6、低速離心機(jī)其轉(zhuǎn)速一般不超過4000rpm ,臺式高速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速可達(dá) 18000rpm。離心機(jī)的一般使用規(guī)程1、離心前，先將離心的物質(zhì)轉(zhuǎn)移入合適的離心管中，其量以距離管口12cm為宜，以免在離心時甩出。將離心管放入外套管中，在外套管與離心管間注入緩沖水，使離心管不易破損。2、取一對外套管 內(nèi)已有離心管）放在臺秤上平衡。如不平衡，可調(diào)整緩沖用水或離心物 質(zhì)的量。將平衡好的套管放在離心機(jī)十字轉(zhuǎn)頭的對稱位置上。把不用的套管取出，并蓋好 離心機(jī)蓋。3、接通電源，開啟開關(guān)。4、待離心機(jī)自行停止轉(zhuǎn)動手，打開機(jī)蓋，取出離心樣品。5、將外套管、橡膠墊沖洗干凈，倒置干燥備用。注意事項1低速離心機(jī)要放在平坦和結(jié)

7、實(shí)的地面或?qū)嶒?yàn)臺上，不允許傾斜。2、一年檢查一次電動機(jī)的電刷及軸承磨損情況，必要時更換電刷或軸承。3、關(guān)閉電源后，要等候離心機(jī)自動停止。不允許用手或其他物件迫使離心機(jī)停轉(zhuǎn)。4、 離心機(jī)應(yīng)接地線，以確保安全。5、離心機(jī)啟動后，如有不正常的噪音及振動時，可能 離心管破碎或相對位置上的兩管重量不平衡，應(yīng)立即關(guān)機(jī)處理。附錄2： 721型分光光度計的原理及使用方法1吸收光譜原理物質(zhì)中分子內(nèi)部的運(yùn)動可分為電子的運(yùn)動、分子內(nèi)原子的振動和分子自身的轉(zhuǎn)動，因 此具有電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級。當(dāng)分子被光照射時，將吸收能量引起能級躍遷，即從基態(tài)能級躍遷到激發(fā)態(tài)能級。而三種 能級躍遷所需能量是不同的，需用不同波長

8、的電磁波去激發(fā)。電子能級躍遷所需的能量較 大，一般在1eV20eV，吸收光譜主要處于紫外及可見光區(qū)，這種光譜稱為紫外及可見光 譜。如果用紅外線（能量為1eV0.025eV照射分子，此能量不足以引起電子能級的躍遷， 而只能引發(fā)振動能級和轉(zhuǎn)動能級的躍遷，得到的光譜為紅外光譜。若以能量更低的遠(yuǎn)紅外 線（0.025eV0.003eV照射分子，只能引起轉(zhuǎn)動能級的躍遷，這種光譜稱為遠(yuǎn)紅外光譜。 因?yàn)槲镔|(zhì)結(jié)構(gòu)不同對上述各能級躍遷所需能量都不一樣，因此對光的吸收也就不一樣，各 種物質(zhì)都有各自的吸收光帶，因而就可以對不同物質(zhì)進(jìn)行鑒定分析，這是光度法進(jìn)行定性 分析的基礎(chǔ)。根據(jù)朗伯一比耳定律：當(dāng)入射光波長、溶質(zhì)、溶

9、劑以及溶液的溫度一定時，溶液的光密度和溶液層厚度 及溶液的濃度成正比，若液層的厚度一定，則溶液的光密度只與溶液的濃度有關(guān)，T - ,E- 一 lg T = lg = a;/厶丁式中，c為溶液濃度，E為某一單色波長下的光密度 （又稱吸光度,Io為入射光強(qiáng)度，I為透射光強(qiáng)度，T為透光率， 為摩爾消光系數(shù)，I為液層厚度。在待測物質(zhì)的厚度I 一定時，吸光度與被測物質(zhì)的濃度成正比，這就是光度法定量分析的依 據(jù)。2分光光度計的構(gòu)造原理將一束復(fù)合光通過分光系統(tǒng)，將其分成一系列波長的單色光，任意選取某一波長的光 ，根據(jù)被測物質(zhì)對光的吸收強(qiáng)弱進(jìn)行物質(zhì)的測定分析，這種方法稱為分光光度法，分光光 度法所使用的儀器稱

10、為分光光度計。分光光度計種類和型號較多，實(shí)驗(yàn)室常用的有72型、721型、752型等。各種型號的分光光度計的基本結(jié)構(gòu)都相同，由如下五部分組成： 光源 （鎢燈、鹵鎢燈、氫弧燈、氘燈、汞燈、氙燈、激光光源> ； 單色器 （濾光片、棱鏡、光柵、全息柵 > ； 樣品吸收池； 檢測系統(tǒng) （ 光電池、光電管、光電信增管 > ； 信號指示系統(tǒng) （檢流計、微安表、數(shù)字電壓表、示波器、微處理機(jī)顯像管>。光源T單色器T樣品吸收池T檢測系統(tǒng)T信號指示系統(tǒng) 2.分光光度計的使用方法在儀器尚未接通電源時，電表指針必須于“0刻”線上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進(jìn)行調(diào)節(jié)。將儀器電源開通，打開比色皿暗箱蓋，選擇需用的波長，然后將比色皿暗箱蓋合上， 比色皿座處于蒸餾水校正位置，使光電管受光，旋轉(zhuǎn)調(diào)“100%”電位器，使電表指針到滿度附近，儀器預(yù)熱 20 分鐘。放大器靈敏度有五檔，是逐步增加的，“1最”低。其選擇原則是保證能使空白檔良好調(diào)到 “100%”的情況下，盡可能采用靈敏度較低檔，這樣儀器將有更高 的穩(wěn)定性。所以使用時一般置 “1，”靈敏度不夠時再逐漸升高，但改變