2葉綠體分離、離體葉綠體還原活性

1、實驗五 葉綠體的分離、離體葉綠體的還原活性一、實驗目的制備具有活性的離體葉綠體和測定希爾反應活力是研究葉綠體結構功能和光合作用機 理的重要技術條件。本實驗通過學習分離制備葉綠體的技術方法，加深對希爾反應的理解及對光反應的認 識。二、實驗原理光合作用機制是一個比較復雜的問題，可分為光反應和暗反應，大致分為三大步驟：<1 ）原初反應 <光能的吸收、傳遞和轉換過程）；<2 ）電子傳遞和光合磷酸化 < 電能轉變?yōu)榛钴S的化學能）；<3）碳同化 <活躍的化學能轉變?yōu)榉€(wěn)定的化學能）。光反應中，由水至 NADP+的電子傳遞是由兩個反應中心PSH和PSI經(jīng)過兩種連續(xù)光化學反應

2、驅(qū)動的，psn的一個重要功能是利用光能使水裂解放氧。光子-+-2H * O2+ 4H + 4e英國生物化學家Hill<1937 ）首先將離體葉綠體加入有適當氫受體<如草酸高鐵鉀鹽，2,6-二氯酚靛酚，NAD+和NADP+）的水溶液中，照光后即有 。2放出，這就是水的光解，即 希爾反應。葉綠體的分離采用離心分級分離，即利用葉綠體的直徑和沉降系數(shù)與其他細胞器不同 的特點，先用低速離心除去細胞碎片，后用高速離心沉降葉綠體。希爾反應活力的測定是 將葉綠體加入氫受體，并照光，水被光解放氧，溶液顏色發(fā)生變化，通過比色測定。三、實驗材料新鮮菠菜葉片。四、設備與試劑分光光度計，離心機，照光裝置 &

3、lt;2只500W鎢燈作為光源），試管，移液管，燒杯， 紗布，研缽等。0.35MNaCI 溶液、O.OIMTris 溶液五、實驗步驟1、離體葉綠體的制備：稱鮮菠菜葉5g,加10ml0.35M NaCl、1ml Tris緩沖液、石英砂，研磨。勻漿用脫脂棉過濾。1000轉/分離心5分鐘，取上清液，3000轉份離心5分鐘。去除上清液，保留沉淀。在沉淀中加入5mlO.35MNaCI，攪勻，得到葉綠體懸浮液。2、希爾反應活力的測定按照下面表格，取三支試管，分別進行不同的操作。將三支試管中的溶液倒入對應的比色杯中，以3號試管調(diào)零，620nm處比色。然后將比色杯置于光源 60cm處照光。表1口呂號0.1ml

4、Tris緩沖液葉綠體2.6-二氯吲哚叮酚19.3ml0.2ml0.5ml29.3ml0.2ml5min0.5ml39.8ml0.2ml六、實驗結果表2口呂號光值1光值2光值3光值4光值5123將所測光值記錄到上表，畫出曲線圖，并分析原因。七、注意事項1、2.6-二氯吲哚叮酚必須在煮沸加熱后滴加。2、溶液加入比色杯就開始計時。3、每次測光時都應調(diào)零和百分比。4、試管加熱時管口不要對準他人。八、思考題1. 試管中藍色褪去的原因是什么 ？與光照有什么關系？2 煮沸對葉綠體有何影響？3 請對結果作出解釋。附錄1：離心機的構造及使用離心機是利用離心力對混合液 含有固形物）進行分離和沉淀的一種專用儀器。實

5、驗 室常用電動低速離心機、高速離心機和低速、高速冷凍離心機，以及超速分析、制備兩用 冷凍離心機等多種型號。其中以低速包括大容量）離心機和高速冷凍離心機應用最為廣泛，是生化實驗室用來分離制備生物大分子必不可少的重要工具。在實驗過程中，欲使沉淀與母液分開，常使用過濾和離心兩種方法。在下述情況下，使用離心方法效果較好。沉淀有粘性或母液粘稠。沉淀顆粒小，容易透過濾紙。沉淀量過多而疏松。沉淀量很少，需要定量測定。或母液量很少，分離時應減少損失。沉淀和母液必須迅速分開。一般膠體溶液。電動低速離心機的基本結構和性能低速離心機結構較簡單，可分小型臺式和落地式兩類，配有驅(qū)動電機、調(diào)速器、定時器等裝置，操作方便。

6、低速離心機其轉速一般不超過4000rpm ,臺式高速離心機最大轉速可達 18000rpm。離心機的一般使用規(guī)程1、離心前，先將離心的物質(zhì)轉移入合適的離心管中，其量以距離管口12cm為宜，以免在離心時甩出。將離心管放入外套管中，在外套管與離心管間注入緩沖水，使離心管不易破損。2、取一對外套管 內(nèi)已有離心管）放在臺秤上平衡。如不平衡，可調(diào)整緩沖用水或離心物 質(zhì)的量。將平衡好的套管放在離心機十字轉頭的對稱位置上。把不用的套管取出，并蓋好 離心機蓋。3、接通電源，開啟開關。4、待離心機自行停止轉動手，打開機蓋，取出離心樣品。5、將外套管、橡膠墊沖洗干凈，倒置干燥備用。注意事項1低速離心機要放在平坦和結

7、實的地面或?qū)嶒炁_上，不允許傾斜。2、一年檢查一次電動機的電刷及軸承磨損情況，必要時更換電刷或軸承。3、關閉電源后，要等候離心機自動停止。不允許用手或其他物件迫使離心機停轉。4、 離心機應接地線，以確保安全。5、離心機啟動后，如有不正常的噪音及振動時，可能 離心管破碎或相對位置上的兩管重量不平衡，應立即關機處理。附錄2： 721型分光光度計的原理及使用方法1吸收光譜原理物質(zhì)中分子內(nèi)部的運動可分為電子的運動、分子內(nèi)原子的振動和分子自身的轉動，因 此具有電子能級、振動能級和轉動能級。當分子被光照射時，將吸收能量引起能級躍遷，即從基態(tài)能級躍遷到激發(fā)態(tài)能級。而三種 能級躍遷所需能量是不同的，需用不同波長

8、的電磁波去激發(fā)。電子能級躍遷所需的能量較 大，一般在1eV20eV，吸收光譜主要處于紫外及可見光區(qū)，這種光譜稱為紫外及可見光 譜。如果用紅外線（能量為1eV0.025eV照射分子，此能量不足以引起電子能級的躍遷， 而只能引發(fā)振動能級和轉動能級的躍遷，得到的光譜為紅外光譜。若以能量更低的遠紅外 線（0.025eV0.003eV照射分子，只能引起轉動能級的躍遷，這種光譜稱為遠紅外光譜。 因為物質(zhì)結構不同對上述各能級躍遷所需能量都不一樣，因此對光的吸收也就不一樣，各 種物質(zhì)都有各自的吸收光帶，因而就可以對不同物質(zhì)進行鑒定分析，這是光度法進行定性 分析的基礎。根據(jù)朗伯一比耳定律：當入射光波長、溶質(zhì)、溶

9、劑以及溶液的溫度一定時，溶液的光密度和溶液層厚度 及溶液的濃度成正比，若液層的厚度一定，則溶液的光密度只與溶液的濃度有關，T - ,E- 一 lg T = lg = a;/厶丁式中，c為溶液濃度，E為某一單色波長下的光密度 （又稱吸光度,Io為入射光強度，I為透射光強度，T為透光率， 為摩爾消光系數(shù)，I為液層厚度。在待測物質(zhì)的厚度I 一定時，吸光度與被測物質(zhì)的濃度成正比，這就是光度法定量分析的依 據(jù)。2分光光度計的構造原理將一束復合光通過分光系統(tǒng)，將其分成一系列波長的單色光，任意選取某一波長的光 ，根據(jù)被測物質(zhì)對光的吸收強弱進行物質(zhì)的測定分析，這種方法稱為分光光度法，分光光 度法所使用的儀器稱

10、為分光光度計。分光光度計種類和型號較多，實驗室常用的有72型、721型、752型等。各種型號的分光光度計的基本結構都相同，由如下五部分組成： 光源 （鎢燈、鹵鎢燈、氫弧燈、氘燈、汞燈、氙燈、激光光源> ； 單色器 （濾光片、棱鏡、光柵、全息柵 > ； 樣品吸收池； 檢測系統(tǒng) （ 光電池、光電管、光電信增管 > ； 信號指示系統(tǒng) （檢流計、微安表、數(shù)字電壓表、示波器、微處理機顯像管>。光源T單色器T樣品吸收池T檢測系統(tǒng)T信號指示系統(tǒng) 2.分光光度計的使用方法在儀器尚未接通電源時，電表指針必須于“0刻”線上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進行調(diào)節(jié)。將儀器電源開通，打開比色皿暗箱蓋，選擇需用的波長，然后將比色皿暗箱蓋合上， 比色皿座處于蒸餾水校正位置，使光電管受光，旋轉調(diào)“100%”電位器，使電表指針到滿度附近，儀器預熱 20 分鐘。放大器靈敏度有五檔，是逐步增加的，“1最”低。其選擇原則是保證能使空白檔良好調(diào)到 “100%”的情況下，盡可能采用靈敏度較低檔，這樣儀器將有更高 的穩(wěn)定性。所以使用時一般置 “1，”靈敏度不夠時再逐漸升高，但改變