大腸桿菌的培養(yǎng)和分離

1、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離的基礎(chǔ)知識(shí)和操作過程梳理一、大腸桿菌細(xì)菌是單細(xì)胞的原核生物。細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等。細(xì)菌無成型的細(xì)胞核，細(xì)胞壁由肽聚糖組成。由于細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，細(xì)菌可分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩類。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁厚，無莢膜，多產(chǎn)生外毒素；革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁薄，有莢膜，多產(chǎn)生內(nèi)毒素。革蘭氏陽性菌對(duì)青霉素更為敏感。大腸桿菌是革蘭氏陰性、異養(yǎng)兼性厭氧型腸道桿菌。在腸道中一般對(duì)人無害，但任何大腸桿菌進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。大腸桿菌在基因工程技術(shù)中被廣泛的應(yīng)用，它的質(zhì)粒是最常用的運(yùn)載體，它也是基因工程中常用的受體細(xì)胞。二、培養(yǎng)基配置微生物生命活動(dòng)過程中需要

2、的化合物有碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、無機(jī)鹽和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生長(zhǎng)因子是微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物，但不一定需要外界補(bǔ)充，有的微生物可以自身合成。在提供上述幾種主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。我們一般用LB液體培養(yǎng)基來擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后可在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離。以下為本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基配置步驟：1 稱量：準(zhǔn)確稱取各成分。蛋白胨0.5g,酵母提取物0.25g,氯化鈉0.5g,力口水50ml。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加1g瓊脂。2 溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加瓊脂，整個(gè)過程不斷用玻棒

3、攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。3 調(diào)pH：用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性。4 滅菌：在兩個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)，1kg壓力滅菌15min。5 倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至60左右時(shí)在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。其過程是：將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。倒過來放置的目的是防止培養(yǎng)基

4、冷卻過程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。向培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移已滅菌的培養(yǎng)基時(shí)，也不要把培養(yǎng)基沾在皿壁上。否則，空氣中雜菌會(huì)在這些粘附培養(yǎng)基上繁殖，并污染皿內(nèi)培養(yǎng)基。三、滅菌和消毒1 無菌技術(shù)：對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行；避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。2 消毒方法：日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法；對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法；對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒；實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒。3 滅菌方

5、法：接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。4 比較消毒和滅菌：比較項(xiàng)理化因素的作用強(qiáng)度消滅微生物的數(shù)量消毒較為溫和芽孢和孢子能否被消滅部分生活狀態(tài)的微生物不能滅菌強(qiáng)烈全部微生物能5 注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)中用的棉花不能用脫脂棉，因脫脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。滅菌后，通常在6080c烘箱中除去滅菌時(shí)的水分；物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開排氣閥，煮沸并排除鍋內(nèi)冷空氣，其目的是有利于鍋內(nèi)溫度升高，隨后關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱，加熱結(jié)束切斷熱源后，要使溫度自然降低，氣壓務(wù)必降至零時(shí)

6、打開鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸；在用任何器皿轉(zhuǎn)接時(shí)，瓶塞和封口膜只能夾在手上，不許放在臺(tái)面上，接種時(shí)要在酒精燈火焰旁操作；培養(yǎng)基一定不能沾在三角瓶口、試管管口和培養(yǎng)皿壁上，否則容易污染；接種時(shí)要膽大心細(xì)，動(dòng)作快捷，這是減少污染的關(guān)鍵；接種后，培養(yǎng)皿必須倒放（蓋在下方）在恒溫培養(yǎng)箱中，如正放則水蒸氣在蓋上凝成水滴，滴到接種后的培養(yǎng)基表面，水流擴(kuò)散會(huì)使菌落擴(kuò)散，就很難形成單菌落了。四、細(xì)菌的分離1 劃線分離法：用接種環(huán)蘸菌液后在含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板上劃線，在劃線過程中菌液逐漸減少，細(xì)菌也逐漸減少。劃線到最后，可使細(xì)菌間的距離加大。在培養(yǎng)1020h后，可由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生單菌落，菌落不會(huì)重

7、疊。如果再將每個(gè)菌落分別接種至含有固體培養(yǎng)基的試管斜面上，在斜面上劃線，則每個(gè)斜面的菌群就是由一個(gè)細(xì)菌產(chǎn)生的后代。其操作步驟是：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線35條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70。角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，

8、倒置于恒溫箱培養(yǎng)。取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進(jìn)行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細(xì)菌污染環(huán)境和操作者。72涂布分離法：先將培養(yǎng)的菌液稀釋，通常稀釋到1010之間，然后取0.1ml不同稀釋度的稀釋菌液放在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上，用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上進(jìn)行培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)南♂尪认?，可產(chǎn)生相互分開的菌落。通常每個(gè)培養(yǎng)皿有20個(gè)以內(nèi)的單菌落最為適合。將每個(gè)菌落分別接種在斜面上擴(kuò)增培養(yǎng)后，再做功能性實(shí)驗(yàn)。劃線分離法，方法簡(jiǎn)單；涂布分離法，單菌落更易分開，但操

9、作復(fù)雜些。細(xì)菌的兩種分離法各有優(yōu)點(diǎn),都可采用。五、菌落和菌種種類的辨認(rèn)單個(gè)細(xì)菌用肉眼是看不見的，但是，當(dāng)單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，便會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。不同種類的細(xì)菌所形成的菌落在大小、形狀、顏色、光澤度、透明度等方面具有一定的特征。細(xì)菌的菌落表面一般是光滑而濕潤(rùn)的，有黏稠性，多數(shù)透明或半透明，但也有細(xì)菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細(xì)的菌絲并可產(chǎn)生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅(jiān)實(shí)多皺，長(zhǎng)孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養(yǎng)基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環(huán)挑動(dòng)；酵母菌落類似于細(xì)菌菌落，表面光滑而濕潤(rùn)，有黏稠性但大多呈乳