實驗五 聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分析小麥幼苗過氧化物酶同工酶(實驗報告)

1、生物化學實驗報告實驗五 聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳分析小麥幼苗過氧化物酶同工酶一、研究背景及目的電泳現(xiàn)象就是帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極泳動。電泳技術最初是由瑞典的著名科學家Tisellius所奠基，自此生物大分子的分離純化便進入了電泳技術的新紀元。電泳技術的發(fā)明是人們在分離純化技術中的“差異轉(zhuǎn)換”思路上又一次偉大的飛躍。人們清楚地意識到，要想使目標物得到分離，目標物與雜質(zhì)之間的性質(zhì)差異必須足夠大，這又與某些性質(zhì)差異小的物質(zhì)的分離相矛盾，而人為放大這些差異小的性質(zhì)必然會破壞目標物的原有結(jié)構，因此需要借助第三者進行差異轉(zhuǎn)化，即以其自身的性質(zhì)為基礎，轉(zhuǎn)化為其他方面差異大的性質(zhì)。電泳技術

2、就是利用一些生物大分子的電性特點，在一定的條件下使被分離物之間很小的差異轉(zhuǎn)化為自身所帶電荷性質(zhì)與數(shù)量的差異，在外加電場的作用下便會體現(xiàn)出遷移方向及速度上的差異，通過時間上的積累進而體現(xiàn)為遷移距離的差異。最初的電泳技術是在溶液中進行的自由電泳，后來人們想到，由于待分離物的大小、形狀也存在差異，那么它們在電場中泳動的過程中必然會受到不同的阻力，這種阻力的差異又轉(zhuǎn)化為了電場中遷移速度的差異，所以人們便發(fā)明了各種用于電泳的載體（支持介質(zhì)），使分子的大小及形狀差異得以轉(zhuǎn)化和體現(xiàn)，大大提高了分辨率。至此，電泳技術的基本理論就建立了。此后，在實際操作中，人們不斷進行探索、改進與完善，發(fā)明了諸多的電泳新技術，

3、使電泳成為一項生物大分子分離純化中令人矚目的研究技術。本實驗基于電泳的基本原理對小麥過氧化物酶同工酶進行分離，旨在學習并掌握電泳技術的發(fā)明歷程以及操作過程中的相關細節(jié)，同時更為深刻地理解一項新技術在實際應用中不斷修正與完善的過程，體會電泳和層析兩大技術各自的特點和優(yōu)勢。二、原理11.過氧化物酶同工酶同工酶是催化同一種化學反應，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構組成卻有所不同的一組酶。它們與生物的遺傳、生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一定關系，測定同工酶在理論上和實踐上都具有重要的意義。本實驗測定的過氧化物酶同工酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與植物的光合、呼吸作用以及生長素的氧化等有關；在植物

4、生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。因此，測定過氧化物酶同工酶的生物活性可以了解某一時期植物體內(nèi)代謝的變化。2.電泳的基本原理帶電粒子在電場中的泳動速度有以下公式：v= Eq6由此可以看出，粒子移動的速度（v）與電場強度（E）和粒子所帶電量成正比，而與粒子的大小（）和溶液的粘度（）成反比。此外，粒子的移動速度還與形狀有關，即非球形粒子（如線形DNA分子）在電泳中會受到更大的阻力。不同帶電顆粒在同一電場中泳動的速度不同，為了便于比較，常用泳動度或遷移率（m）來表示，遷移率是指帶電顆粒在單位電場強度下泳動的速度。其數(shù)學表達式如下： m= vE = q6由上式可以看出，遷移率m僅與帶電粒子所帶電荷的

5、數(shù)量、粒子大小及形狀和溶液粘度有關，而與電場強度無關。又因為氨基酸、蛋白質(zhì)、酶等的電離度隨著溶液pH的變化而變化，所以在實際點臃腫，常使用有效遷移率這個概念，有效遷移率（）定義為遷移率（m）和當時條件下電離度的乘積。即：=m·= q.63.聚丙烯酰胺凝膠的形成及特點這種凝膠是以丙烯酰胺單體（Acrylamide，簡寫為Acr）和交聯(lián)劑N，N'-甲叉雙丙烯酰胺（N，N'-Methylena Bisacrylamide，簡寫為Bis）在催化劑的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它們單獨存在或混合在一起時是穩(wěn)定的，且具有神經(jīng)毒性，操作時應避免接觸皮膚。但在具有自由基團體系時

6、，它們聚合。引發(fā)產(chǎn)生自由基團的方法有兩種，即化學法和光化學法?；瘜W聚合的引發(fā)劑是過硫酸銨 （NH4）2S2O3（Ammonium persulfate，簡寫為Ap），催化劑是N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，簡寫為TEMED）。在催化劑TEMED的作用下，由過硫酸銨（Ap）形成的自由基又使單體形成自由基，從而引起聚合作用。TEMED在低pH時失效，會使聚合作用延遲；冷卻也可使聚合速度變慢；一些金屬抑制聚合；分子氧阻止鏈的延長，防礙聚合作用。這些因素在實際操作時都應予以控制。4.凝膠系統(tǒng)及特點本實驗采用不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)，分離小

7、麥苗過氧化物酶同工酶，系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：（1）凝膠板由上、下兩層膠組成，兩層凝膠的凝膠孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。（2）緩沖液離子組成及各層凝膠的pH值不同，本實驗采用堿性系統(tǒng)，電極緩沖液為pH8.3 的Tris-Gly 緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl 緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl 緩沖液.（3）由于pH不連續(xù)，在電場中形成了不連續(xù)的電位梯度。在該不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在著三種物理效應，即電荷效應、分子篩效應和濃縮效應，在這三種效應的共同作用下，待測物能夠被很好地分離開來。以本實驗要分離的小麥過氧化物酶同工酶為例，分別說明這

8、三種效應的作用：A. 電荷效應：各種酶蛋白按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場作用下向一定電極，以一定速度泳動。B. 分子篩效應：分子量小，形狀為球形的分子在電泳過程中受到阻力較小，移動較快；反之，分子量大、形狀不規(guī)則的分子，電泳過程中受到的阻力較大，移動較慢。這種效應與凝膠過濾過程中的情況不同。C. 濃縮效應：待分離樣品中的各組分在濃縮膠中會被壓縮成層，而使原來很稀的樣品得到高度濃縮。5.樣品的檢測與分析過氧化物酶在分解過氧化氫的過程中產(chǎn)生自由氧基，能使聯(lián)大茴香發(fā)生顏色反應，產(chǎn)生褐色的化合物，所以用聯(lián)大茴香胺染色液浸泡過的凝膠板上，有過氧化物酶同工酶蛋白質(zhì)帶的部位可以看到褐色的譜帶。通過分析該譜

9、帶，即可對小麥不同器官過氧化物酶的種類及含量進行比較。三、儀器與試劑儀器：DYY型電泳槽（北京六一儀器廠）、DYY2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）、W7微量進樣器（上海醫(yī)用激光儀器廠）。器具：微量可調(diào)手動移液器（大龍）、微量進樣器（50l）、燒杯50ml×4、廢液缸、膠頭滴管、大培養(yǎng)皿；試劑：蒸餾水、2瓊脂、分離膠緩沖液（pH8.9 Tris-HCl緩沖液）、濃縮膠緩沖液（pH6.7 Tris-HCl緩沖液）、分離膠丙膠貯液（Acr-Bis貯液）、濃縮膠丙膠貯液（Acr-Bis貯液）、過硫酸銨溶液（Ap）、電極緩沖液（pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液）、pH4.7乙酸緩沖液、0.

10、5溴酚藍溶液、聯(lián)大茴香胺染色液、四甲基乙二胺（TEMED）原液；材料：小麥幼苗及根部提取樣液。四、操作步驟1.凝膠的制備（1）將貯液由冰箱取出，待與室溫平衡后再配制工作液；（2）安裝電泳槽。安裝時，注意旋緊螺絲時，需均衡用力，以免夾碎玻璃片；（3）用2%的瓊脂糖封底，以防漏膠；（4）按下表所示配制分離膠名稱分離膠緩沖液分離丙膠無離子水TEMED過硫酸銨用量（ml）1.32.76.00.0400.4在小燒杯中混勻后，立即灌膠，灌膠時，將電泳槽略微傾斜，用手扶穩(wěn)，將小燒杯尖端 抵在長玻璃片頂端中央某點，小心倒入兩玻璃片之間，灌至距短玻璃片頂端2cm左右即可，放平電泳槽，立即用滴管在膠的上層小心輕緩

11、地覆蓋約23mm厚的水層；灌注水層時要均勻輕緩，以防在膠頂部產(chǎn)生漏洞，影響結(jié)果，剛加水時，可看出界面，后逐漸消失，等到再出現(xiàn)界面時，表明分離膠已聚合，再靜置一會兒，便可將水倒出，可用濾紙條從一側(cè)略微吸浸，注意不要碰毀膠面，然后準備灌注濃縮膠。（5）按下表所示配制濃縮膠名稱濃縮膠緩沖液濃縮丙膠無離子水TEMED過硫酸銨用量（ml）0.51.02.20.0150.2配制均勻后，立即灌膠，操作同分離膠的灌注，當膠面達到距短玻璃片0.5cm左右即可，然后立即插入樣品槽模板（梳子）。聚合完成后，在電泳槽內(nèi)倒入電極緩沖液，然后小心撥出梳子，準備點樣。2.點樣取已配制好的小麥幼苗及根部提取樣液，用微量進樣器

12、小心吸取樣品液加入到樣品槽內(nèi)。梯度上樣，每種樣品分別上樣5l、15l、30l、50l。3.電泳接好電源線（上槽接負極，下槽接正極）。打開電源開關，調(diào)節(jié)電流（濃縮時15mA，分離時20mA）。待前沿指示染料下行至距膠板末端0.51cm處時，即可停止電泳。4.剝膠、染色及結(jié)果記錄電泳結(jié)束之后，將垂直板從電泳槽上取下，小心地將兩塊玻璃板分開，并小心地將凝膠置于大培養(yǎng)皿中，進行染色反應。染色過程如下：A.向大培養(yǎng)皿中倒入約50ml pH4.7乙酸緩沖液，將膠板淹沒，室溫浸泡10min。B.倒掉乙酸緩沖液，加入聯(lián)大茴香胺染色液，將膠板淹沒，室溫下浸泡20min，在此期間會出現(xiàn)過氧化物酶同工酶的譜帶，待染

13、色條帶充分顯色后觀察記錄酶譜并分析結(jié)果。五、實驗結(jié)果六、討論與分析實驗結(jié)果無非告訴我們一點，即小麥不同部位過氧化物酶的種類及含量并不相同。具體進行以下分析：（1）縱向來看，最終的電泳圖譜上共發(fā)現(xiàn)了6條帶，他們代表著小麥體內(nèi)含有6中不同類型的過氧化物酶。（2）小麥葉部總共含有5中不同的過氧化物酶，即酶1、2、3、4、6；小麥根部共含有4中不同的過氧化物酶，即酶1、2、5、6。（3）1、2、6為小麥根部及葉部共有的3種過氧化物酶，從含量上比較，對比同一上樣量所得到的結(jié)果，根部的蛋白條帶亮度高于葉部，即這3種酶的含量高于葉部。（4）對同一部位樣品來說，不同上樣量得到的條帶亮度不一，因此為了得到最適的

14、顯色亮度，確定最佳上樣量是非常必要的。七、結(jié)論與展望（1）本次實驗達到了預期的結(jié)果，通過聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳對小麥不同部位過氧化物酶同工酶的進行了分離和鑒定，并對其種類與數(shù)量進行了分析討論。（2）“差異轉(zhuǎn)化”以及“揚長避短”是電泳技術自誕生至現(xiàn)在不斷發(fā)展過程中的所遵循的基本路線，這兩個思路能夠給我們帶來一些啟示。（3）技術是科技得以發(fā)展的基礎，而科技的發(fā)展又是技術不斷更新的源源動力。對于生物大分子的分離、純化、鑒定，可以預言在未來肯定會出現(xiàn)與層析技術、電泳技術相仿且具有頑強生命力的新技術。八、質(zhì)疑與相關思考pH4.7的乙酸緩沖液作用究竟是什么？為什么浸泡10min？這個問題在實驗預習中已經(jīng)

15、討論過，我有新的看法。之前我查閱資料，有證據(jù)顯示在聚丙烯酰胺凝膠電泳之后都需要對樣品條帶進行固定，一般是將凝膠浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸幾分鐘即可達到效果，其分子不僅與蛋白質(zhì)帶正電荷側(cè)鏈結(jié)合，而且通過氫鍵與蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)合，其結(jié)果使蛋白質(zhì)分子失去水分子，同時在肽鏈表面包上一層疏水的-CCl3或者-CH3基團，使蛋白質(zhì)水溶性破壞，從水相沉淀在凝膠相上。2現(xiàn)在想想還是不太對，照這個原理講蛋白質(zhì)的活性就受到影響了，此后的染色鑒定就無法進行。個人感覺pH4.7的乙酸緩沖液應該是為顯色反應提供最適的pH環(huán)境。浸泡時間應該是前人摸索出來的最佳時間，顯色時間過短不能夠使乙酸緩沖液充分擴散至凝膠內(nèi)部，

16、不利于其后的顯色反應；浸泡時間過長則有可能會使樣品條帶有一定程度的擴散。九、思考題1.電泳凝膠緩沖系統(tǒng)（電極緩沖液、濃縮膠緩沖液、分離膠緩沖液）在電泳技術中的作用？（1）電極緩沖液的作用具有導電作用，構成電泳回路的一部分；提供弱堿性的緩沖體系（pH8.3）；提供Gly（pI=5.97），在不同pH下具有相應的解離度；為蛋白樣品提供與之相匹配的離子強度等。（2）濃縮膠緩沖液的作用提供前導離子Cl-；提供接近中性的緩沖環(huán)境（pH6.7），甘氨酸解離度很小，成為尾隨離子，最終形成電位梯度，產(chǎn)生濃縮效應。（3）分離膠緩沖液的作用提供pH8.9的緩沖環(huán)境，使甘氨酸解離度劇增，消除不連續(xù)的高電位梯度，使分

17、離過程僅靠電荷效應及分子篩效應進行。2.樣品中加入40%蔗糖溶液的作用是什么？增加樣品的比重，使樣液能夠沉到樣品槽的底部；增加樣品的粘度，使樣品不容易發(fā)生側(cè)向的擴散以免干擾結(jié)果。3.兩側(cè)電泳槽中的電極緩沖液使用過一次之后，是否可以回收再用？為什么？正負極槽中的電極緩沖液基本上是相互分離的，沒有直接接觸，下面分別討論（1）對于正極槽中的電極緩沖液來說，由于濃縮膠及分離膠中的Cl-始終作為前導離子向正極移動，最終進入到正極的電極緩沖液當中；此外，由于Gly在電泳過程中的遷移，也有可能進入到正極槽的電極緩沖液中，使Gly含量發(fā)生變化。這兩者都會使電極緩沖液成分發(fā)生改變，故不能夠繼續(xù)使用。（2）對于負

18、極槽中的電極緩沖液來說，首先一點是它接觸到了樣品液，必然會受到一定程度的污染。其次如上所述，其成分中Gly含量會有所下降，故也不能夠繼續(xù)使用。4.利用電泳技術獲得漂亮實驗結(jié)果的關鍵因素主要是那些？（1）凝膠的制備目的是要制備出均一性良好的凝膠。聚合時過硫酸銨最后加入，之前加入的緩沖液、丙膠、去離子水及TEMED應充分混勻；灌膠時傾斜電泳槽，速度緩慢均一；灌注水層時均勻輕緩，避免在凝膠頂部產(chǎn)生漏洞；吸水時濾紙條切莫碰毀凝膠面；梳子拔出時不要用力過大，緩慢均一垂直向上用力，否則會嚴重損毀樣品槽；倒入電極緩沖液的量要把握好，短玻璃板一側(cè)沒過玻璃片頂端，長玻璃板一側(cè)沒過電極絲（不要加多，浪費且增加電阻

19、）。（2）點樣注意樣品在樣品槽中的分布順序，一般來說從兩側(cè)到中間樣品量梯度減少，以避免橫向擴散的發(fā)生。但是如果樣品槽出新了損毀，應該對上樣順序作出適當調(diào)整。（3）電泳正確連接電源線，上槽接負極、下槽接正極；控制好電流，指示劑前沿在濃縮膠與分離膠中時電流強度不一樣，此外電流設置還要考慮溫度等因素的影響。（4）剝膠及染色剝膠時戴手套，且不要接觸到凝膠面，以免損壞樣品條帶；乙酸緩沖液浸泡時間需要控制為10min。5.應用或研究的需要和理論上的可行性以及實踐中的可操作性是一項技術得以發(fā)明的三大前提條件，而完成后的應用實效反過來又會對前期的設計予以進一步修正和指導甚至提出新的問題，比較電泳技術與層析技術

20、的異同點，說明為何基于進一步提高生物大分子純化水平而被發(fā)明的電泳技術，最終卻是更為廣泛地應用于樣品的分析鑒定而并非最初定位的分離純化？這種轉(zhuǎn)化給我們什么啟示？（1）異同點的比較比較項目層析技術電泳技術純度大致相同回收量較高（上樣量大）較低（上樣量受限制）回收方式收集管連續(xù)收集切除凝膠，析出目標物等簡單繁瑣鑒定不易進行非常方便（2）電泳技術廣泛應用于樣品分析鑒定而非分離純化對于分離純化來說，衡量一種技術優(yōu)劣性的標準就是看最終得到樣品的純度以及回收量（這里考慮一次實驗的回收量）。電泳技術發(fā)明的初衷是為了分離純化，在實際的應用中發(fā)現(xiàn)，與層析技術相比，就技術本身的基本原理而言，二者分離樣品的純度基本相差不大。但是在回收量這一方面，層析技術的上樣量明顯比電泳技術要高很多，而增加電泳的上樣量就意味著增加凝膠的厚度，考慮到電熱等因素的影