臍血CD34+細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞兩種來(lái)源的樹突狀細(xì)胞特性的比較研究

1、    臍血CD34+細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞兩種來(lái)源的 樹突狀細(xì)胞特性的比較研究        【摘要】目的體外大量擴(kuò)增和純化具有典型表型、形態(tài)和功能的樹突狀細(xì)胞（DC），以進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。方法采用免疫磁珠法分離臍血CD34+細(xì)胞及外周血去B、去T淋巴細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞(單核細(xì)胞)，然后以GM-CSF、IL-4、TNF-、Flt3配基(FL)、SCF等不同的細(xì)胞因子配伍，分別誘生DC，通過(guò)流式細(xì)胞儀、電鏡、光鏡分析其特性，同時(shí)檢測(cè)其刺激同種T細(xì)胞增殖的能力。

2、結(jié)果臍血與外周血誘生DC的方案不同，由臍血CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)DC時(shí)，GM-CSF+TNF-+SCF+FL組合可使CD1a+細(xì)胞比例增至（27.18±1.56）%，明顯高于單獨(dú)應(yīng)用GM-CSF組(0.65±0.38)%。外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的DC，則GM-CSF+高劑量IL-4（1 000 U/ml）組合效率最高，誘生的CD1a+細(xì)胞可達(dá)（21.80±0.32）%。兩種來(lái)源的DC在表型及形態(tài)上差異無(wú)顯著性，兩者同樣具有刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力。結(jié)論從臍血和外周血均可誘生DC，根據(jù)應(yīng)用目的的不同對(duì)其進(jìn)行選擇，這為DC用于臨床治療選擇不同細(xì)胞來(lái)源提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！娟P(guān)

3、鍵詞】樹突細(xì)胞造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子造血干細(xì)胞單核細(xì)胞 Studies on the properties of dendritic cells from cord blood CD34+ cells and peripheral blood monocytesWANG Xiao, PEI Xuetao, LI Liang, et al. Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing100850【Abstract】ObjectiveEx vivo expansion and purification of dendritic cells(DC) w

4、ith typical phenotype, morphology and function are critical to the further studies on DC and their clinical application. MethodsCD34+ cells were isolated from umbilical cord blood by using a high-gradient magnetic cell sorting system (MACS), and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were deplete

5、d of T and B cells by mixing them with T/CD2 and B/CD19 magnetic beads. DC were induced and expanded with different combinations of cytokines. They were identified for their properties by FACS, electronic microscopy, microscopy, and mixed lymphocyte reaction (MLR). Results Cultures of cord blood CD3

6、4+ cells with the combination of GM-CSF+TNF-+SCF+FL yielded （27.18±1.56）% CD1a+ cells,much higher than that (0.65±0.38)% with GM-CSF alone. The combination of GM-CSF and high dose IL-4(1 000 U/ml) was the most potential for expanding CD1a+ cells (21.8±0.32)% for PBMC. Both of the DC f

7、rom different sources were similar in phenotype and morphology, and had the capacity to stimulate proliferation of allogeneic T lymphocytes. Conclusion Both of cord blood and peripheral blood are the source for generation of a large number of typical DC, and can be adopted for the application accord

8、ing to different purposes. These results lay foundation for the immunotherapy with DC.【Key words】Dendritic cellsHematopoietic cell growth factorsHematopoietic stem cellsMonocytes樹突狀細(xì)胞（dendritic cell , DC）因其專職遞呈抗原、刺激體內(nèi)初始T細(xì)胞，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有獨(dú)特的地位1。DC在組織中含量甚微，其來(lái)源的困難限制了研究的深入。近年來(lái)有關(guān)DC誘生方案的探討已成為熱點(diǎn)，其中包括尋求DC合適的來(lái)源

9、、最佳的細(xì)胞因子配伍及應(yīng)用順序、完善的培養(yǎng)條件等。因前體細(xì)胞來(lái)源不同，采用的細(xì)胞因子也不盡相同2，3。目前，從DC典型的形態(tài)、膜表面表達(dá)的主要組織相容性抗原復(fù)合物(MHC)類分子、能移行至淋巴器官和刺激初始T細(xì)胞增殖活化，及其特異性表面標(biāo)志等可確認(rèn)DC4。誘生方案成熟后，可根據(jù)不同目的選擇不同細(xì)胞來(lái)源誘生DC，開(kāi)展DC在腫瘤、感染、移植免疫、自身免疫等方面的研究，從而為實(shí)現(xiàn)DC的臨床應(yīng)用創(chuàng)造條件。材料和方法1材料MiniMACS磁性分離儀為德國(guó)Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品；Coulter免疫磁性分離儀Coulter Immunotech生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀為美國(guó)FACScan BDIS產(chǎn)

10、品；鈷源為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；液閃計(jì)數(shù)儀為Beckman產(chǎn)品。臍血及外周血均采自解放軍總醫(yī)院。GM-CSF為Glaxo產(chǎn)品；IL-4為Promega產(chǎn)品；TNF-為Genzyme產(chǎn)品；SCF為Sandos產(chǎn)品；FL為Immunex產(chǎn)品。單克隆抗體(單抗)CD34 QBEND/10為Miltenyi Biotec產(chǎn)品；PE標(biāo)記鼠抗人CD1a單抗、FITC標(biāo)記鼠抗人CD80單抗和FITC標(biāo)記鼠抗人HLA-DR單抗，購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司；免疫磁珠吸附的CD2、CD19單抗為Coulter Immunotech產(chǎn)品；免疫磁珠吸附的DC單抗為Coulter Immunotech產(chǎn)品。2臍血CD3

11、4+細(xì)胞的分離純化采用MiniMACS免疫磁性分離系統(tǒng)進(jìn)行5。臍血（CB）經(jīng)5g/L的甲基纖維素沉降，經(jīng)Ficoll（相對(duì)密度為1.077）梯度離心分離出單個(gè)核細(xì)胞（CBMNC），洗滌后標(biāo)記抗體與磁珠（抗CD34抗體為QBEND/10，磁珠為羊抗鼠IgG1免疫磁珠，均為15稀釋）。標(biāo)記細(xì)胞在通過(guò)置于磁場(chǎng)中的分離柱時(shí)，洗脫除去CD34-細(xì)胞，將分離柱移出磁場(chǎng)，加壓洗脫，收集組分為CD34+細(xì)胞。3外周血單核細(xì)胞的分離純化采用Coulter吸附單克隆抗體-磁珠陰性選擇系統(tǒng)。按上述方法從外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMNC），以T、B淋巴細(xì)胞特異性CD2、CD19單抗-磁珠標(biāo)記細(xì)胞，置于磁場(chǎng)中用以去除

12、T、B淋巴細(xì)胞，待細(xì)胞懸液的上清清亮后（約10分鐘），吸取上清，用緩沖液離心洗滌，收集到的細(xì)胞即為單核細(xì)胞。4樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)臍血CD34+細(xì)胞與外周血單核細(xì)胞以5×103/ml接種于12孔板中，每孔1 ml。培養(yǎng)體系IMDM含體積分?jǐn)?shù)為12.5%的HS和FCS、5×10-7mol/L氫化考的松以及不同組合的GM-CSF（40 ng/ml）、TNF-（50 U/ml）、SCF（100 ng/ml）、FL（40 ng/ml）和IL-4（400 U/ml、1 000 U/ml）。37 、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)，每周半量換液。5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型CD1a與HLA-D

13、R均采用直接標(biāo)記法，將細(xì)胞分成不同組別，CD1a為PE熒光標(biāo)記，CD80和HLA-DR為FITC熒光標(biāo)記，抗體以110稀釋，4 孵育30分鐘，洗滌兩次，重新懸浮后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。6電鏡分析透射電鏡觀察：DC懸液離心，細(xì)胞沉淀用體積分?jǐn)?shù)為4%的戊二醛和體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸固定，梯度乙醇脫水，經(jīng)超薄切片鉛鈾染色后，透射電鏡觀察并攝片。掃描電鏡觀察：DC懸液用PBS洗兩次，體積分?jǐn)?shù)為4%的戊二醛固定后，PBS洗1次，制成懸液滴片，體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸固定，梯度乙醇脫水，掃描電鏡觀察并攝片。7DC刺激同種T細(xì)胞增殖反應(yīng)7.1分離純化T淋巴細(xì)胞： 采用Coulter CD2免疫磁珠陽(yáng)性選擇系統(tǒng)分離T細(xì)

14、胞。人外周血單個(gè)核細(xì)胞1×107/ml 與100 l CD2磁珠混勻，作用10分鐘后置于磁場(chǎng)中，待上清清亮后，移棄上清，將細(xì)胞移出磁場(chǎng)，充分洗滌吸附于管壁上的細(xì)胞，此為陽(yáng)性選擇的T細(xì)胞，用作同種T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。7.2DC刺激同種T細(xì)胞增殖反應(yīng)：DC與PBMC以每孔1×103，3×103，1×104接種于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，經(jīng)60Co 射線照射滅活（3 000 cGy），然后每孔加入1×105 T淋巴細(xì)胞，共培養(yǎng)4天，于培養(yǎng)結(jié)束前16小時(shí)加入3H-TdR,18.5kBq/孔，反應(yīng)結(jié)束時(shí)收集細(xì)胞，液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)放射性核素每分鐘閃爍計(jì)數(shù)值。8

15、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。結(jié)果1細(xì)胞因子配伍對(duì)DC生成的影響臍血CD34+細(xì)胞為造血干/祖細(xì)胞，外周血單核細(xì)胞含有向DC分化的髓系前體細(xì)胞，二者在細(xì)胞因子作用下經(jīng)兩周的培養(yǎng)均可向DC定向誘導(dǎo)分化。臍血CD34+細(xì)胞單獨(dú)加入GM-CSF體外培養(yǎng)時(shí)，以生成單核細(xì)胞為主，CD1a+細(xì)胞僅占（0.65±0.38）%，而不同的細(xì)胞因子組合可使CD1a+細(xì)胞的比例增至（4.12±0.60）% （27.18±1.56）%（組間比較，P<0.01）。結(jié)果表明，不同細(xì)胞因子配伍對(duì)DC的誘導(dǎo)效率顯示出差異，TNF-（50 U/ml）為臍血CD34+細(xì)胞定向誘導(dǎo)DC所

16、必需，它可加速DC的成熟；在GM-CSF+TNF-的組合中加入SCF或FL，對(duì)臍血DC的誘生有明顯的協(xié)同作用，CD1a+細(xì)胞的比例分別增加至（12.3±0.33）%和（18.0±0.11）%，F(xiàn)L的作用更為明顯。IL-4的量對(duì)DC的誘生效率有很大影響，400 U/ml以下誘生的細(xì)胞，CD1a+細(xì)胞僅占（3.30±0.16）%，大多數(shù)細(xì)胞在形態(tài)上更趨向巨噬細(xì)胞而不是DC，當(dāng)IL-4加至1 000 U/ml時(shí)，CD1a+細(xì)胞為（21.8±0.32）%(組間比較，P<0.01)。2DC的形態(tài)與表型在GM-CSF、TNF-、FL、SCF的組合中，臍血CD3

17、4細(xì)胞誘生的DC量最高，表型檢測(cè)CD1a+細(xì)胞占（27.18±1.56）%,CD80+細(xì)胞的比例為（42.28±3.16）%，HLA-DR表達(dá)占（93.7±1.0）%。培養(yǎng)至第8天，光鏡下觀察，細(xì)胞不貼壁，胞膜向外延伸出尖刺狀突起。透射電鏡下觀察，DC的幔狀突起更加清晰，胞漿內(nèi)有大量線粒體聚集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，溶酶體及吞噬體不多。掃描電鏡示DC的粗糙表面和層疊狀的皺襞。外周血的單核細(xì)胞在GM-CSF、IL-4誘生1周后即出現(xiàn)DC，較CD34+細(xì)胞來(lái)源DC體積小，電鏡特點(diǎn)與前述差異不明顯。兩種來(lái)源的DC均在第8天時(shí)以流式細(xì)胞儀（FACS）分析其表型，結(jié)果顯示了細(xì)胞因子組

18、合、濃度與其表達(dá)量的關(guān)系：外周血單核細(xì)胞在IL-4為400 U/ml時(shí)，產(chǎn)生的主要是巨噬細(xì)胞。CD1a+細(xì)胞占（3.3±0.16）%，當(dāng)IL-4用量達(dá)8001 000 U/ml時(shí)，DC才較多，CD1a+、CD80+和HLA-DR+細(xì)胞的比例分別為（21.8±0.32）%、（50.2±3.12）%和（94.6±1.58）%。3DC的免疫刺激活性DC刺激T細(xì)胞增殖反應(yīng)時(shí)，當(dāng)刺激細(xì)胞(外周血單核細(xì)胞-DC或臍血CD34細(xì)胞-DC)與T細(xì)胞的比例為110時(shí)，細(xì)胞3H-TdR摻入量分別為（60.80±1.26）×103/min和（48.20&#

19、177;1.41）×103/min，兩組比較差異無(wú)顯著性;但兩組分別與對(duì)照組（7.20±1.16）×103/min和（9.00±0.97）×103/min比較，P值均<0.01，差異有顯著性，說(shuō)明臍血CD34+細(xì)胞與外周血單核細(xì)胞誘生的DC均能激發(fā)同種異體T細(xì)胞的增殖，有較強(qiáng)的抗原遞呈能力。討論細(xì)胞因子配伍及應(yīng)用順序在不同細(xì)胞來(lái)源DC的誘生中作用不同。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，臍血CD34+細(xì)胞作為DC的一種來(lái)源，其細(xì)胞因子組合中除需要GM-CSF和TNF-的支持外，SCF和FL也是有明確擴(kuò)增協(xié)同效應(yīng)的兩種因子，SCF、FL存在的實(shí)驗(yàn)組中，其CD

20、1a+細(xì)胞比例由GM-CSF+TNF-組的（4.12±0.6）%分別增至（12.3±0.33）%和（18.0±0.11）%（組間比較，P<0.01）。目前，認(rèn)為FL的作用與CD34+細(xì)胞表達(dá)高水平的Flt3有關(guān)，兩者結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。另外，F(xiàn)L可提高DC前體細(xì)胞的數(shù)量并延長(zhǎng)其存活時(shí)間。由外周血的單核細(xì)胞誘生的DC，其產(chǎn)生量與表型的表達(dá)明顯依賴于IL-4的加入量，且細(xì)胞形態(tài)也由巨噬細(xì)胞為主轉(zhuǎn)向DC為主，這說(shuō)明IL-4在早期加入可抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化。在功能檢測(cè)中，外周血單核細(xì)胞與臍血CD34+細(xì)胞誘生的DC與T細(xì)胞的比例為110時(shí)，兩種來(lái)源的DC差異無(wú)顯著性，都有刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力，能發(fā)揮較強(qiáng)的抗原遞呈能力，均可作為誘生DC的理想來(lái)源。目前有學(xué)者認(rèn)為，DC功能的發(fā)揮更多的是在病變部位或病原體與DC接觸的微環(huán)境中，因此對(duì)這些DC進(jìn)行深入探討可能更有實(shí)際意義。本課題受國(guó)家杰出青年科學(xué)基金（39825111）資助作者單位：100850北京