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文檔簡介
1、 DNA膠回收中常見問題分析 DNA膠回收中常見問題分析1、如何計算提取率?1) 回收前樣品中,往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等,所以不能用測回收前后吸光度的的方法計算回收率;2) 可將回收前后DNA 片段一起電泳,使用凝膠成像系統(tǒng)拍照后,用配套的軟件進行電泳條帶灰度對比;3) 注意,電泳條件及拍攝條件將對灰度對比結果造成很大影響,請仔細操作,以減小誤差。2、如何簡易測算提取率? 取膠回收后的DNA溶液體積的1/51/10,與等體積的回收前的DNA溶液的510倍稀釋液一起電泳,肉眼觀察回收后的條帶相對于回收前條帶的亮度,粗略測算回收率(如亮度只有一半時,其回收率可粗略為50%)。
2、 3、如何看待提取得率?影響回收率的因素很多,如DNA片段大小、點樣量、凝膠種類、電泳緩沖液的緩沖能力、切膠操作、紫外燈照射強度和時間、溶膠是否徹底等等,所以不能單憑1-2次的實驗來判斷其質量好壞,最好是多做幾次實驗或用幾種不同品牌的產品做平行對照實驗,結果相對真實。 4、回收率為什么與點樣量和片段大小有關?DNA片斷越大,和固相基質的結合力越強,就越難洗脫,回收率就低;DNA的量越少,相對損失越大,回收率越低。5、用膠回收試劑盒從凝膠中回收DNA得率低是什么原因?1) 膠塊溶解不完全,可適當延長水浴時間和上下顛倒的次數(shù)以及增加溶膠液的比例;2) 膠塊體積太大,應使用槍頭搗碎,還不能充分溶解則
3、先將其切為小塊,分多次回收;3) 紫外燈下切膠時間過長,導致DNA部分降解,應盡量把切膠時間控制在30s以內;4) 洗滌液使用后未及時蓋嚴瓶蓋,乙醇揮發(fā),影響回收效率;5) TAE或TBE電泳緩沖液不新鮮,失去了緩沖能力,導致PH值升高,降低DNA和膜的吸附力,應及時更換電泳緩沖液,最好使用新鮮配制的電泳緩沖液,效果更好。6) 回收前的樣品量太少,加大點樣量7) 洗脫前,預先65預熱洗脫液、延長室溫靜置時間、增加洗脫次數(shù)可以有效提高回收率30%以上。6、加入溶膠液溫浴后,液體仍很粘稠或后續(xù)步驟有堵柱子現(xiàn)象? 1) 膠塊溶解不充分,可再補加一些溶膠液或延長水浴時間并增加上下顛倒次數(shù)幫助溶膠; 2
4、) 膠塊體積過大,應盡量切除多余部分,并將其切為小碎塊,分幾次回收; 3) 水浴溫度是否達到規(guī)定溫度65,用溫度計檢測。7、瓊脂糖凝膠塊不溶? 1) 瓊脂糖質量不好; 2) 含目的片斷的凝膠在空氣中放置過久,使膠塊失水干躁,建議切膠后立即進行回收或將膠塊保存于4 或-20; 3) 制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。8、點樣時發(fā)現(xiàn)DNA樣品有漂出點樣孔外的現(xiàn)象?柱子上的乙醇未完全揮發(fā)干凈,延長室溫下空柱靜置時間以確保乙醇完全揮發(fā)干凈。9、能否使用去離子水洗脫回收?可以,但是實驗室所用去離子水一般PH值偏低,可用NaOH適當調高PH值7.0,以增加回收得率。10、能否使用TE(PH8.0)洗脫?可以
5、11、可否使用小于30l的洗脫液進行洗脫?不可以。因為說明書提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積。12、關于DNA片段大小與回收率的問題? 100bp-500bp,30-60%;500bp-4kb,80-95%;4kb以上,30-50%。13、OD值與瓊脂糖凝膠中的DNA產量不相符?從柱子上洗脫下來的痕量雜質增加了A260的值14、吸光度純度測定時應注意的問題吸光度測量的是未知樣品與調零標準之間的相對吸光度,所以請用與洗脫液體相同的液體,對測量樣品進行稀釋和調零。15、為什么溶膠不徹底會影響回收結果的純度?在電泳過程中,DNA會與大分子的多糖緊密的結合在一起,凝膠的種類和質量不同,DNA與之結合力也不同,只有凝膠充分溶解,DNA才能充分釋放,否則,凝膠將與DNA一起沉淀下來,洗脫后將影響回收結果的純度。 廣州市珀爾生物科技開發(fā)有限公司生產地址:深圳市龍崗區(qū)龍坪西路
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