鈣離子濃度在轉(zhuǎn)化生長因子α和β1誘導的體外人卵泡膜細胞凋亡中的變化

1、    鈣離子濃度在轉(zhuǎn)化生長因子和1誘導的體外人卵泡膜 細胞凋亡中的變化        【摘要】目的探討細胞內(nèi)游離鈣離子(Ca2+)濃度與轉(zhuǎn)化 生長因子(TGF)和轉(zhuǎn)化生長因子1(TGF1)誘導的體外人卵泡膜細胞凋亡的關系。方法用TGF和TGF1聯(lián)合作用誘導體外無血清培養(yǎng)的人卵泡膜細胞發(fā) 生凋亡，利用光鏡、電鏡、瓊脂糖凝膠電泳從形態(tài)學、生化指標方面進行凋亡檢測，用粘附 細胞分析及篩選激光細胞儀觀察細胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化。結(jié)果TGF和TGF1聯(lián)合作用可引起凋亡的人

2、卵泡膜細胞內(nèi)游離Ca2+濃度 升高。結(jié)論Ca2+可能是在TGF和TGF1所致人卵泡膜細胞 凋亡過程中參與信號傳遞的重要因素?！娟P鍵詞】細胞凋亡卵泡閉鎖人卵泡膜細胞轉(zhuǎn)化生長因子 游離鈣Cytosolic Free Calcium Changes in Apoptotic Human Theca Folliculi Cells Induced by Transforming Growth Factor an 1 in VitroLuo JiaLiu JingXing Fuqi（Armed Police Hospital of Guangdong, Guangzhou 510507）【Abstrac

3、t】ObjectiveTo study the relationship between cytosolic free calcium and apoptosis of human theca folliculi cells induced by Transforming Growth Factor (TGF) plus Tran sforming Growth Factor 1(TGF1).MethodsWe detected human theca folliculi cells apoptosis induced by TGF plus TGF1 i n vitro by means o

4、f optical microscope,electronic microscope and agarose gel ele ctrophoresis,cytosolic free calcium changes in apoptotic human theca folliculi cells by Adherent Cell Analysis and Sorting Interactive Laser Cytometer.ResultsCytosolic free calcium in apoptotic theca folliculi cells induced by TGF plus T

5、GF1 increased apparently compared with control groups.ConclusionThis study shows that cytosolic free calcium may par ticipate the signal regulation during apoptosis of human theca folliculi cells i nduced by TGF plus TGF1.【Key words】ApoptosisFollicular atresiaHuman theca folliculi cellTransforming g

6、rowth f actorFree calcium 目前國內(nèi)關于人卵泡膜細胞凋亡的研究尚屬空白，我們的實驗研究已經(jīng)證明TGF和TGF 1同時存在可誘導體外無血清培養(yǎng)的人卵泡膜細胞發(fā)生凋亡。為了更深入地了解人卵泡膜細 胞凋亡的信號傳遞機制，本文應用粘附細胞分析及篩選激光細胞儀觀察凋亡細胞內(nèi)Ca2+ 濃度的變化，以期為今后進一步研究人卵泡膜細胞凋亡的內(nèi)在調(diào)控機制提供初步的研究資 料。1資料與方法1.1研究對象本研究病例為10例具有正常月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌的病人， 年齡3035歲。于 月經(jīng)周期第914天行根治性子宮切除術時，從切除的卵巢中采取直徑約15mm卵泡共26個。 立即置于預冷的PB

7、S液中。術中冰凍及術后病理報告，10例雙側(cè)卵巢均無癌細胞轉(zhuǎn)移及病理 性改變。1.2人卵泡膜細胞的獲取和培養(yǎng)人卵泡膜細胞的獲取和培養(yǎng)參照文獻1，2 進行。在無菌條件下，用眼科剪剪開卵泡壁，PBS液緩慢沖洗將顆粒細胞沖洗出卵泡腔，將 剩余的卵泡剪成1mm×1mm的小塊，置 于含0.25%胰酶和0.02%EDTA和PBS液中37孵育1015分鐘，盡可能去除殘余的顆粒細胞 ， 然后將組織塊用含1%FBS的PBS液洗2次，用含3g/L膠原酶和5mg/L牛胰腺DNase的PBS孵 育45min，每隔15min用吸管吸棄未消化的組織塊。然后將卵泡膜細胞懸液用含1%FBS的DMEM 培養(yǎng)基洗3次，重

8、懸于含10%FBS的培養(yǎng)基中，用臺盼藍染色檢測細胞的存活，細胞濃度調(diào)至 每亳升3×105個，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔0.5ml，37，5%CO2培養(yǎng)。1.3TGF和TGF1誘導體外人卵泡膜細胞凋亡模型的建立參照文獻，選擇10g/L 作為TGF、TGF1的作用濃度。將培養(yǎng)的卵泡膜細胞分為4組， 每組設4個復孔。細胞培養(yǎng)2小時后，棄去培養(yǎng)液，DHank's液洗2遍，換成無血清培養(yǎng)液。 第13組為實驗組分別加入10g/L TGF、10g/L TGF1、10g/L TGF加10g/L TG F1，第4組為正常對照組，37，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，于培養(yǎng)后3h、6h、12h、24h，動態(tài)觀

9、 察細胞形態(tài)變化。1.4細胞凋亡的檢測3普通光鏡觀察：采用HE染色法。透射電鏡觀察 。生化指標檢測：提取細胞DNA，進 行瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.5凋亡細胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化的研究41.5.1單個細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的動態(tài)變化卵泡膜細胞培養(yǎng)2小時后，吸去培養(yǎng) 基，DHank's液洗3次，加入50 l20M的Fluo3AM染料，37避光染色1小時，DHa nk' s液洗3次，加入0.5ml DHank's液，上粘附式細胞儀，預掃描3min。加入TGF及TGF 1，繼續(xù)掃描20min。測定掃描過程中Ca2+濃度動態(tài)變化。1.5.2不同處理組間細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的差

10、異卵泡膜細胞培養(yǎng)2小時后，吸去 培養(yǎng)基，DHank's液洗3次，換成無血清培養(yǎng)基，分別加入TGF、TGF1、TGF加TGF1 ，同時設正常對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，吸去培養(yǎng)基，DHank's液洗3次，加入 50l 20M的Fluo3AM染料，37避光染色1小時，DHank's液洗3次，加入0.5ml D Hank's液，上粘附式細胞儀，測定各組Ca2+濃度，每組測定34個視野，200個 細胞。整個檢測過程中所用試劑不含Ca2+，保證無外源性Ca2+的影響。1.5.3統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)經(jīng)ACAS 570微機系統(tǒng)測量獲得，以±s表示，將三個實驗組分別與對照組進

11、行均數(shù)間兩兩比較。2結(jié)果2.1TGF和TGF1作用后卵泡膜細胞的形態(tài)學變化2.1.1HE染色光鏡觀察結(jié)果培養(yǎng)2小時后的卵泡膜細胞，加入TGF加TGF1后，約3小 時細胞體積開始縮小，12小時部分細胞變圓、上浮，隨時間推移上浮細胞增多，24小時將爬 片生長的細胞經(jīng)HE染色，光鏡下觀察可見典型的凋亡形態(tài)學改變：細胞體積變小，胞質(zhì)收縮 、深染，呈淡紅色，核染色質(zhì)濃縮，呈藍黑色，聚集于核膜下呈境界分明的顆粒塊狀小體， 可見部分細胞膜出泡以及細胞膜包裹碎裂的核而成的凋亡小體，而TGF和TGF1單獨處理 無此作用。2.1.2透射電鏡觀察結(jié)果電鏡下觀察到正常卵泡膜細胞細胞核為卵圓形，胞質(zhì)中滑面 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，

12、線粒體豐富，嵴多呈管狀，高爾基復合體及脂滴廣泛分布。而本研究TGF加T GF1誘導的凋亡細胞形態(tài)呈染色質(zhì)濃縮，聚集于核膜下呈境界分明的塊狀或月形小體，細 胞漿濃縮或細胞核裂解成質(zhì)膜包繞的碎片，細胞質(zhì)可見完整的細胞器。2.2TGF和TGF1作用后卵泡膜細胞凋亡的生化指標檢測結(jié)果體外培養(yǎng)的卵泡膜細胞 經(jīng)TGF、TGF1、TGF加TGF1作用24小時后，提取細胞總DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳，從譜可以看出經(jīng)TGF加TGF1作用后的細胞DNA譜為180200bp 及其倍數(shù)的片段，呈梯子狀(ladder)，而單獨作用的細胞其DNA譜不呈現(xiàn)梯狀帶。說明經(jīng)T GF加TGF1作用后卵泡膜細胞DNA在核小體連接部

13、位發(fā)生了斷裂。2.3TGF和TGF1誘導的凋亡卵泡膜細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化2.3.1卵泡膜細胞內(nèi)游離Ca2+濃度動態(tài)變化熒光標記后，ACAS 570開始動態(tài)掃 描 。以處理前預掃描所測得的值為基數(shù)1，掃描全過程中所得熒光值與預掃描熒光值的比值則 代表細胞內(nèi)Ca2+濃度的相對熒光值。本研究結(jié)果，負荷TGF加TGF1后，熒光值迅 速升 高，于負荷后70s達峰值為3.4，之后開始下降，第300s降至2.95時出現(xiàn)一平臺期，第500s 時又下降，第900s時降至2.0，熒光值為負荷前基值水平的2倍。2.3.2不同處理組間卵胞膜細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的差異TGF組、TGF 1組、TGF加TGF1組

14、及對照組的卵泡膜細胞內(nèi)游離Ca2+濃度由ACAS 570測定，每組 測定34個視野，200個細胞，熒光值結(jié)果以±s表示，見表1 。表1各組TGF和TGF1作用后細胞內(nèi)游離Ca2+濃 度的熒光值組別細胞數(shù)±s對照組280371.32±3.58TGF484388.33±5.26TGF1267362.33±4.36TGF+TGF1173417.35±2.211)注：1)與對照組相比，P0.01 由表1可見，與正常對照組相比，TGF組與TGF1組Ca2+濃度無明 顯差異(P0.2)，TGF加TGF1組Ca2+濃度顯著升高(P0.01)，表明T

15、G F 和TGF1聯(lián)合作用能引起卵泡膜細胞漿游離Ca2+濃度升高，而單獨作用對Ca2+ 濃度沒有影響。3討論大量的研究證明，細胞內(nèi)適宜的Ca2+可能通過活化Ca2+依賴的內(nèi)切核酸酶 激發(fā)DNA的降解，Ca2+鈣調(diào)素依賴性蛋白磷酸化酶的激發(fā)也與觸發(fā)細胞凋亡過程有 關5，另外，Ca2+與細胞骨架的磷酸化和去磷酸化密切相關，造成凋亡細 胞的皺縮、變形、膜出泡等一系列形態(tài)學改變，最終死亡6。細胞內(nèi)Ca2+ 濃度被認為是參與細胞凋亡信號傳遞的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡是卵泡閉鎖的根本機制 7。在卵泡閉鎖的過程中，顆粒細胞與卵泡膜細胞相繼以凋亡的形式消退8 。 許多致凋亡因素可引起凋亡細胞內(nèi)Ca2+濃度升

16、高，如一些物理因素、毒性因子、細 胞因子、病毒感染及免疫相關機制的作用。這些凋亡過程常伴有凋亡的重要生化標志即染色 質(zhì)的有控降解，DNA在核小體連接部位斷裂為180200bp的亞單位片段或其倍數(shù)的片段，其 瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)梯形譜，此過程被認為與內(nèi)源性Ca2+、Mg2+依賴性內(nèi)切 酶(endonuclease)有關5；Arend等還認為，內(nèi)源性內(nèi)切核酸酶有選擇地被活化 不 僅與DNA的有序斷裂有關，且是凋亡時細胞核形態(tài)變化的重要原因6。目前對凋亡 過程中的關鍵內(nèi)切核酸酶的定性和提取仍是困難的，原因在于活化過程中酶的不穩(wěn)定性及 在眾多凋亡例子中被活化的候選內(nèi)切酶的多樣性。另外，依賴于Ca2+的酶

17、還有鈣蛋白 酶(calpain)和谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(transglutaminase)，它們被認為分別與細胞骨架紊亂與細胞 皺縮、胞漿蛋白質(zhì)交聯(lián)和維持凋亡小體完整、防止細胞內(nèi)涵物外溢等有關。Bennett9 等研究發(fā)現(xiàn)，細胞表面的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)對于凋亡的細胞被 周圍的細胞識別及吞噬清除是必不可少的，此過程也是Ca2+依賴的。另外，Ca2+ 還能激活多聚ADP核糖聚合酶(PARP)，后者有改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，使聚合的核小體 松懈，減弱組蛋白DNA相互接觸，以使DNA更易被核酸內(nèi)切酶接近?？梢?，胞漿內(nèi)Ca2+ 的濃度變化是凋亡發(fā)生的重要信號機制之一。然而，

18、有一些凋亡的發(fā)生過程，卻并不依賴 于Ca2+濃度的增加，且細胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶的活化不被Ca2+激活，而是為Zn 2+所抑制10。事實上，胞內(nèi)Ca2+增加可導致增殖和凋亡雙重改變，其最 終指向取決于 次級信號的有無，若Ca2+增加，未被激活，則不能抑制Ca2+和(或)PKC對核酸 內(nèi) 切酶的激活作用，造成DNA降解，細胞凋亡；反之，若PKC被激活則凋亡途徑被抑制，細胞呈 現(xiàn)增殖狀態(tài)。這種一個信號調(diào)節(jié)兩種相反過程的現(xiàn)象，體現(xiàn)了細胞功能調(diào)控中的節(jié)約機制， 也為細胞在不同環(huán)境條件下不同的狀態(tài)提供了解釋。本實驗應用粘附細胞分析儀及篩選激光細胞儀觀察了TGF和TGF1聯(lián)合作用誘導卵泡膜 細胞凋亡后胞內(nèi)游離C

19、a2+濃度的變化。ACAS 570是一種比較簡單、快速的檢測培養(yǎng)細 胞內(nèi)游離Ca2+的方法，既可動態(tài)觀察細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化，又可反應細 胞形態(tài)。本實驗所用的熒光探針是Ca2+螯和劑EGTA的衍生物，對Ca2+有較高的 特異性親和力，其本身不能透過細胞膜，將其接一個酯性基團AM后才能導入細胞中，經(jīng)細胞 內(nèi)的非特異性酯酶水解該酶鏈，釋放出Fluo3，F(xiàn)luo3與胞漿Ca2+結(jié)合后可 被488nm波長的激光激發(fā)產(chǎn)生熒光，其熒光強度與Ca2+濃度成正比，據(jù)此可測定卵泡 膜 細胞內(nèi)Ca2+濃度及其變化。結(jié)果表明，TGF和TGF1聯(lián)合作用可使胞漿內(nèi)Ca2+ 濃度快速升高，說明Ca2+參與了TGF

20、和TGF1誘導的體外人卵泡膜細胞凋亡的信 號傳遞過程。這僅提供了一個初步的研究成果，其內(nèi)在調(diào)控機制還有待繼續(xù)深入研究。本課題由國家自然科學基金(編號 39670756)資助作者單位：羅嘉（武警廣東省總隊醫(yī)院婦 產(chǎn)科廣州，510507）劉菁（第一軍醫(yī)大學分子免疫研究所廣州，510515）邢福祺（第一軍醫(yī)大學南方 醫(yī)院婦產(chǎn)科廣州，510515）參考文獻1，Lobb DK,Skinner MK,Dorrington JH.Rat thecal/interstitial cells produce amitogenic activity that promotes the growth of gran

21、ulosa cells:molecular and c ellular.Endocrinology,1988;55:2092，Christina B,Olsson JH.Regulation of androgen production in cultured hu man thecal cells by insulinlike growth factor and insulin.Fertil Steril,199 3;59:3233，姜泊，周殿元.分子生物學常用實驗方法.北京：人民軍醫(yī)出版社，1996：171 4，張薇，樸英杰，鮑永耀，等.粘附式細胞儀測定巨噬細胞內(nèi)游離鈣的方法.第一 軍醫(yī)大學學報，1994；14(1)：435，Wyllie AH,Arends MJ,Morris RG,et al.The apoptosis endonuclease and its regulation.Semin Immunol,1992;4:3896，Lemaster JJ,Diguiseppi J,Mieminen A,et al.Blebbing free Ca2+ and mi