單克隆抗體說(shuō)課講解

1、單克隆抗體技術(shù)【原理及意義】單克隆抗體技術(shù)（The technique of monoclonal antibody）是由 Kchler 和 Milstein 于1975 年創(chuàng)立的。他們發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合,形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體 , 又可無(wú)限增殖 , 從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。單克 隆抗體 （monoclonal antibody,M cAb） 具有結(jié)構(gòu)均一、純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、交叉反 應(yīng)少或無(wú)等優(yōu)點(diǎn) , 缺點(diǎn)是其鼠源性對(duì)人具有較強(qiáng)的免疫原性, 反復(fù)人體使用后可誘導(dǎo)產(chǎn)生人抗鼠的免疫應(yīng)答 , 從而削弱其作用 , 甚至導(dǎo)致免疫病理?yè)p傷。制備單克

2、隆抗體包括動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測(cè)抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆 化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)等一系列實(shí)驗(yàn)步驟。下面按照制備單克隆抗體的流 程順序 , 逐一介紹其實(shí)驗(yàn)方法。一、細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備（一）免疫方案 選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合的成功 , 獲得高質(zhì)量的 M cAb 至關(guān)重要。一般要 在融合前兩個(gè)月左右確立免疫方案開(kāi)始初次免疫 , 免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性而定。1. 顆粒性抗原免疫性較強(qiáng) , 不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例：免疫細(xì)胞數(shù)為每只小鼠 1 X 107/0.5 m L生理鹽水，腹腔注射。1）初次免疫，間隔23周。2）第二次免疫 ，間隔 3周。3）第

3、三次免疫 1 0天后，取血測(cè)效價(jià)。4）加強(qiáng)免疫 3天后，取脾融合。2. 可溶性抗原免疫原性弱 ， 一般要加佐劑。將抗原和佐劑等體積混合在一起 ， 研磨成油包水的乳糜狀 （放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)）。1）初次免疫 ，Ag5 50微克/只，加弗氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射 ，一般0.2 毫升/點(diǎn)，間隔 3周。2）第二次免疫 ，劑量途徑同上 ，加弗氏不完全佐劑 ，間隔 3周。3）第三次免疫 ，劑量同上 ，不加佐劑 ，于生理鹽水中腹腔注射 ，7 10天后采血測(cè)其效 價(jià)，檢測(cè)免疫效果 ， 間隔 23周。4）加強(qiáng)免疫，劑量50卩g為宜，腹腔或靜脈注射。5）3 天后 ， 取脾融合。

4、（二）飼養(yǎng)細(xì)胞在制備單克隆抗體過(guò)程中 ， 許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞 ， 如 ： 在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化 和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中 ， 加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有 ： 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞，也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3 T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞 ， 使用比較方便 ， 照射后可放入液氮罐長(zhǎng)期保存 ， 隨用隨復(fù)蘇。 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備 ：1 .采用與免疫小鼠相同的品系 ，常用 610周齡 B A LB/c 小鼠。2. 拉頸處死 ， 浸泡于 75%酒精中 ， 消毒 3 5 min， 用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)皮膚 ， 暴露腹膜。 用無(wú)菌注射器注入 68 m L

5、培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗，吸出沖洗液。3. 放入10 m L離心管,1200rpm 離心56 min。4. 用20%、牛血清（N CS）或胎牛血清（F CS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1 X 105/m L。加入 96孔板,100微升/孔,放入37C、C O2孵箱培養(yǎng)。一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備 ， 一只小鼠可獲得 5X1068X 106腹腔巨噬細(xì)胞 ， 若用小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞 ，細(xì)胞濃度為 5X106/m L， 小鼠脾細(xì)胞為 1X106/m L， 小鼠成纖維細(xì)胞（3 T3）為1 X 105/m L,均為100微升/孔。（三）骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系 , 這樣雜交融合率高

6、 , 也便于接種雜交瘤細(xì) 胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量M cAb。常用骨髓瘤細(xì)胞系有：N S1、SP2/0、X63、Ag8.653 等。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)用一般的培養(yǎng)液，如R P M 11640、D M E M培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%- 20%,細(xì)胞的最大密度不得超過(guò) 106/m L, 一般擴(kuò)大培養(yǎng)以1 : 10稀釋傳 代,每35d傳代一次。細(xì)胞的倍增時(shí)間為1620 min,上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或輕微貼壁生長(zhǎng) , 只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開(kāi)始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞 , 為確保該細(xì)胞對(duì) H A T 的敏感 性, 每 36月應(yīng)用 8-A G（8 氮雜鳥(niǎo)

7、嘌呤 ）篩選一次 , 以防止細(xì)胞的突變。保證骨髓瘤細(xì) 胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 , 形態(tài)良好?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)高于 95%,也是決定細(xì)胞融合成敗的關(guān)鍵。（四）免疫脾細(xì)胞免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)的脾臟中B淋巴母細(xì)胞漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫 3d以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時(shí)B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合 的成功率較高。脾細(xì)胞懸液的制備 ：在無(wú)菌條件下取出脾臟 ,用不完全的培養(yǎng)液洗一次 ,置平皿中不 銹鋼篩網(wǎng)上 , 用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾 臟體積的 2 倍, 細(xì)胞數(shù)為 2X 108左右。二、細(xì)胞融合及雜交瘤的選擇（一）細(xì)胞融合流程1. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的骨髓瘤細(xì)

8、胞 SP2/0,1000rp m 離心 5 min, 棄上清 ,用不完全培養(yǎng)液混 懸細(xì)胞后計(jì)數(shù) , 取所需的細(xì)胞數(shù) , 用不完全培養(yǎng)液洗滌 2 次。2. 同時(shí)制備免疫脾細(xì)胞懸液 ,用不完全培養(yǎng)液洗滌 2次。3. 將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1 : 10或1 : 5的比例混合在一起，在50 m L塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗 1次,1200rp m,8 min 。4. 棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PE G的濃度。5. 輕輕彈擊離心管底 , 使細(xì)胞沉淀略為松動(dòng)。6. 在室溫下融合 ：（1）30s內(nèi)加入37C預(yù)熱的1 m L、45%PE G（M erck,相對(duì)分子質(zhì)量 4000）,含5%D MS

9、O, 邊加邊攪拌。（2）作用 90s, 若冬天室溫較低時(shí)可延長(zhǎng)至 120s。 加預(yù)熱37 C的不完全培養(yǎng)液，終止PE G作用，連續(xù)每2 min內(nèi)分別加入1 m L、2 m L、 3 m L、 4 m L、 5 m L 和 10 m L。7. 離心 ,800rpm,6 min 。8. 棄上清 ,先用 6 m L 左右 20%小牛血清 R P M I1640 輕輕混懸 ,切記不能用力吹打 , 以免使融合在一起的細(xì)胞散開(kāi)。9. 根據(jù)所用 96孔培養(yǎng)板的數(shù)量 ,補(bǔ)加完全培養(yǎng)液 , 每塊 96孔板需 10 m L。10將融合后的細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板,100微升/孔,37 C、5%C O 2

10、孵箱培養(yǎng)。（二）H A T選擇雜交瘤小鼠骨髓瘤細(xì)胞與免疫的小鼠脾細(xì)胞在融合劑聚乙二醇（PE G）的作用下，細(xì)胞間發(fā)生隨機(jī)的融合 , 形成具有 5 種細(xì)胞成分的混合體 , 其中包括未融合的骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì) 胞, 骨髓瘤細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞與脾細(xì)胞以及骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞三類融合細(xì)胞,只有骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞融合才能成為雜交瘤細(xì)胞。要從眾多細(xì)胞中得到雜交瘤細(xì)胞 , 首要問(wèn)題就是清除兩種親本細(xì)胞及其各自融合形成的同核體細(xì)胞。由于小鼠脾細(xì)胞在體 外培養(yǎng)條件下只能存活幾天 , 且不能增殖 , 因此它不會(huì)影響雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng) ; 而小鼠的 骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)能力極強(qiáng) , 增殖速度快 , 所以要篩選出雜交瘤細(xì)胞

11、 , 必須及時(shí)清除骨髓瘤 細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的同核體細(xì)胞。為此應(yīng)用次黃嘌呤 (H) 、氨基喋呤 (A) 和胸腺嘧啶核苷 (T) 選擇性培養(yǎng)液 (H A T) 加入融合后的培養(yǎng)系統(tǒng)中。 骨髓瘤細(xì)胞的 D N A 合成有兩條途徑 : 一條是生物合成的主要途徑 , 由氨基酸及其他 小分子化合物合成核苷酸，進(jìn)而合成D NA。在此途徑中，葉酸衍生物是必不可少的媒介 物, 它參與嘌呤環(huán)和胸腺嘧啶甲基的生物合成。H A T 培養(yǎng)液中的氨基喋呤是葉酸拮抗劑， 因此可以阻斷骨髓瘤細(xì)胞內(nèi) D N A 合成的主要途徑。另一條途徑是補(bǔ)救途徑或稱替 代途徑 ， 正常細(xì)胞可利用 H A T 培養(yǎng)液中的次黃嘌

12、呤和胸腺嘧啶核苷， 在次黃嘌呤 - 鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(H G R PT)和胸腺嘧啶核苷激酶(T K)的催化下經(jīng)旁路合成 D N A。骨 髓瘤細(xì)胞是經(jīng)過(guò) 8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤 (8-A G) 或 6-巰基鳥(niǎo)嘌呤 (6-T G) 篩選而得到的遺傳 基因缺陷型的細(xì)胞系 ，骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤 (鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 H G R PT-) 或 胸腺嘧啶核苷激酶 (T K-) 。因此， 當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞主要合成途徑被氨基喋呤阻斷后 ，由于 其缺乏上述兩種酶 ， 從而導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞在 H A T 培養(yǎng)系統(tǒng)中的死亡。由骨髓瘤細(xì)胞與 B 細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞由于從B細(xì)胞獲得上述兩種酶，則能利用補(bǔ)充在培養(yǎng)液中的

13、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷經(jīng)旁路途徑合成 D N A， 使雜交瘤細(xì)胞得以生存和擴(kuò)增。加H A T選擇培養(yǎng)的時(shí)間和濃度：一般在融合24h后,加H A T選擇培養(yǎng)液(H T和 H A T均有50X商品化試劑，用時(shí)1 m L加入50 m L20%小牛血清完全培養(yǎng)液中)。 因?yàn)樵谂囵B(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200 微升/孔， 所以在加選擇培養(yǎng)液時(shí)應(yīng)加 3 倍量的 H A T。50X H A T : H： 5X 10-3mol/LA : 2 X 10-5m ol/LT : 8 X 10-4mol/L 一般用 H A T 選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后 ， 改用 H T 培養(yǎng)液 ， 再維持培養(yǎng)兩周 ， 改

14、用一 般培養(yǎng)液。三、抗體的檢測(cè)篩選雜交瘤細(xì)胞通過(guò)選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中 ， 僅少數(shù)能分泌針對(duì)免疫原的 特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底 1/10 面積時(shí)， 即可開(kāi)始檢測(cè)特異性抗體 ，篩選 出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。檢測(cè)抗體應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同， 選擇不同的篩選方法 ， 一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感為原則。1. E LISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細(xì)胞和病毒等 M cAb的檢測(cè)。2. RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞 M cAb的檢測(cè)。3. F A CS(熒光激活細(xì)胞分類儀)用于檢查細(xì)胞表面抗原的 M cAb檢測(cè)。4.IF A 用于細(xì)胞和病毒 M cAb的檢測(cè)。四、雜交瘤的克隆化

15、和凍存克隆化一般是指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過(guò) H A T 篩選后的雜交瘤克隆不 能保證一個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)克隆。在實(shí)際工作中 ， 可能會(huì)有所需要的抗體 (特異性抗體 )分 泌細(xì)胞和其它無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開(kāi) ， 就需要克隆化?？寺』?原則是 ， 對(duì)于檢測(cè)抗體陽(yáng)性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化 ， 否則抗體分泌的細(xì)胞會(huì)被抗體 非分泌的細(xì)胞所抑制 ， 因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度比抗體分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)速度快， 二者競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果會(huì)使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過(guò)的雜交瘤細(xì)胞也需要定期地再克隆， 以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失， 從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。(一)克隆化方法 克隆化的

16、方法很多 ，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。1 .有限稀釋法(1) 制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液 ( 同融合前準(zhǔn)備 )。陽(yáng)性孔細(xì)胞的計(jì)數(shù),并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1 X 1035X 103/m L 。(3) 取130個(gè)細(xì)胞放入 6.5 m L 含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液 ,即20個(gè)細(xì)胞每毫升 ,100 微升/孔加A B、C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞。余下2.9 m L細(xì)胞懸液補(bǔ)加2.9 m L含飼養(yǎng)細(xì)胞的 完全培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個(gè)每毫升,100微升/孔加D E、F三排,為每孔1個(gè)細(xì)胞。余下 的2.2 m L 細(xì)胞懸液補(bǔ)加 2.2 m L 含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液 ,細(xì)胞數(shù)為 5個(gè)每毫升,100微 升/孔，加G H兩排,為每孔

17、0.5個(gè)細(xì)胞。(4) 培養(yǎng) 45d 后, 在倒置顯微鏡上可見(jiàn)到小的細(xì)胞克隆,補(bǔ)加完全培養(yǎng)液 200微升/孔。(5) 第 8 9d 時(shí) , 肉眼可見(jiàn)細(xì)胞克隆 , 及時(shí)進(jìn)行抗體檢測(cè)。注: 初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加H T。2. 軟瓊脂平板法(1) 軟瓊脂的配制 :含20%FCS小牛血清)的2倍濃縮的 RP MI1640;1%瓊脂水溶液：高壓滅菌,42 C預(yù)熱；0.5%瓊脂液：由1份1%瓊脂加1份含20%、牛血清的2倍濃縮的RP M I1640配制 而成,置42 C保溫。(2) 用上述0.5%瓊脂液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞)15 m L傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫 中待凝固后作為基底層備

18、用。(3) 按 100/m L,500/m L 或 5000/m L 等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。(4) 1 m L、0.5%瓊脂液(42 C預(yù)熱)在室溫中分別與1 m L不同濃度的細(xì)胞懸液相混合。(5) 混勻后立即傾注于瓊脂基底層上，室溫10 min,使其凝固，孵育于37C、5%C O 2孵箱中。46d后即可見(jiàn)針尖大小白色克隆,710d后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的 24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。(7) 檢測(cè)抗體 , 擴(kuò)大培養(yǎng) , 必要時(shí)再克隆化。(二)雜交瘤細(xì)胞的凍存 及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞和每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因?yàn)?在沒(méi)有建立一個(gè)穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時(shí)候 , 細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中

19、隨時(shí)可能發(fā)生細(xì)胞的 污染、分泌抗體能力的喪失等等。雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣 , 原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1 X 1 06以上,但對(duì)原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變 ,在24孔培養(yǎng)板中培 養(yǎng), 當(dāng)長(zhǎng)滿孔底時(shí) , 一孔就可以凍成一支安瓿。細(xì)胞凍存液:50%小牛血清,40%不完全培養(yǎng)液,10%D M SO(二甲亞砜)。凍存液最好預(yù)冷，操作動(dòng)作輕柔、迅速。凍存時(shí)從室溫可立即降到0C ,再降溫時(shí)一般按每分降溫2 C3 C ,待降至-70 C可放入液氮中；或細(xì)胞管立即放入-70 C超低溫 冰箱,次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇,檢查細(xì)胞的活性

20、和分泌抗體的穩(wěn)定性 , 在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間。五、單克隆抗體的鑒定對(duì)制備的 M cAb 進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的 , 應(yīng)對(duì)其做如下方面的鑒定 ：1 .抗體特異性的鑒定 ：除用免疫原 (抗原)進(jìn)行抗體的檢測(cè)外 ,還應(yīng)用與其抗原成分第二篇綜合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn)，方法可用E LISA、IFA法。例如制備抗黑色素瘤細(xì)胞的 M cAb, 除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外 , 還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng),以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體 ,應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng) ,其次是與其它細(xì)胞因子間有無(wú)交叉。2.M

21、 cAb 的 Ig 類與亞類的鑒定 :一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選 時(shí), 已經(jīng)基本上確定了抗體的 Ig 類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠 IgG 或 Ig M,則檢測(cè)出來(lái)的抗體一般是IgG類或Ig M類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心 ELISA來(lái)確定。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時(shí)，如加入適量的PE G(3%),將有利于沉 淀線的形成。3. M cAb中和活性的鑒定：用動(dòng)物的或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定 M cAb的生物學(xué)活性。 例如如果確定抗病毒 M cAb 的中和活性 , 則可用抗體和病毒同時(shí)接種于易感的動(dòng)物或敏 感的細(xì)胞 , 來(lái)觀察動(dòng)物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。4. M cAb 識(shí)別抗原表位的鑒定 ：用生物傳感器、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、測(cè)相加指數(shù)的方法 ,測(cè) 定M cAb所識(shí)別抗原位點(diǎn)，來(lái)確定McAb的識(shí)別的表位是否相同。5. M cAb親和力的鑒定：用生物傳感器、E LISA或RIA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)來(lái)確定 M cAb 與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力?！咀⒁馐马?xiàng)】由于制備M cAb的實(shí)驗(yàn)周