曲安奈德抑制BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管生長

1、曲安奈德抑制BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管生長         11-03-03 13:30:00     作者：高小燕，何守志    編輯：studa20【摘要】  目的：觀察光凝后即刻玻璃體腔內(nèi)注射曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)對BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)生長的抑制作用機制。方法：健康BN大鼠36只隨機分為兩組，隨機抽取一眼作為實驗眼

2、。建立BN大鼠CNV動物模型。光凝后的即刻行玻璃體腔內(nèi)注射TA 8L(320g)，對照組則在光凝眼行玻璃體腔內(nèi)注射BSS 8L。分別在光凝后1，2，4wk各處死動物6只，摘除眼球，制作石蠟切片，利用光鏡觀察不同時間點的CNV的變化。利用免疫組化的方法對NFB，MCP1和FRAg蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量檢測，并用原位雜交法檢測VEGF的基因表達(dá)，并行半定量檢測。結(jié)果：實驗1，2，4wk，與對照組相比NFB，MCP1和FRAg蛋白表達(dá)及VEGF的基因表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論：TA能夠降低NFB，MCP1等的表達(dá)和VEGF的轉(zhuǎn)錄，故TA是治療CNV的一種有效的藥物。 【關(guān)鍵詞】 

3、; 曲安奈德;脈絡(luò)膜新生血管;核因子B;單核細(xì)胞趨化蛋白1;血管內(nèi)皮生長因子;因子相關(guān)抗原;積分光密度AbstractAIM: To observe the inhibition of krypton induced choroidal neovascularization (CNV) of brown norway (BN) rat by intravitreal triamcinolone acetonide(TA) injection after photocoagulation, and to study the mechanism of inhibition of CNV growt

4、h.METHODS: Thirtysix healthy BN rats were divided randomly to two groups, one eye was chosen randomly as experimental eye. After establishing BN rat CNV model, 8L(320g) TA was injected in vitreous immediately after photocoagulation in treatment group, the same volume isotonic balanced salt solution

5、(BSS) was injected in vitreous in the contrast group. Eyes of 6 BN rats were enucleated for histological slices in 1 week, 2,4 weeks. The protein expression of nuclear factorkappa B (NFB), monocyte chemoattractant protein1(MCP1), factorrelated antigen(FRAg)was examined by immunohistochemical method,

6、 and the transcription of vascular endothelial growth factor mRNA(VEGFmRNA) was Examined by in situ hybridization, meanwhile semiquantitative analysis was conducted.RESULTS: In treatment group, the positive stain optical density of NFB, MCP1, FRAg, and VEGFmRNA was obviously lower the contemporaneou

7、s control group(P<0.05).CONCLUSION: TA can lower the expression of VEGF mRNA transcription and the protein expression of NFB, MCP1 and FRAg, so it can effectively inhibit the development of BN rat CNV, which indicats that TA is an effective drug to treat CNV.KEYWORDS：triamcinolone acetonide; chor

8、oidal neovascularization; nuclear factorkappa B; monocyte chemoattractant protein1; vascular endothelial growth factor; factor related antigen; integrated optical density      0引言人們對濕性ARMD所致的CNV的治療方法做了大量臨床和實驗研究,目前尚無確切療法，主要有激光光凝、玻璃體手術(shù)切除CNV和放射治療。這些方法不可避免地有損傷健康組織的潛在危險。藥物治療方法如皮質(zhì)

9、類固醇1、抗血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、脫氧氟尿嘧啶核苷和煙曲霉素類似物等正逐漸引起人們關(guān)注，其療效有待進(jìn)一步臨床觀察。我們僅采用光凝后即刻BN大鼠玻璃體腔內(nèi)注射曲安奈德(TA)的方法來探討該藥對激光光凝誘導(dǎo)的CNV的發(fā)生發(fā)展的抑制作用及機制。1材料和方法1.1材料 氪激光機(美國Coherent公司，型號Novua 2000);Topcon OMS300型眼科手術(shù)顯微鏡;微量進(jìn)樣器(25L)(上海安亭微量進(jìn)樣器廠);ImageProPlus 5.1圖像分析系統(tǒng)(美國Media cybernetics公司)。TA注射液(1mL:40mg)(昆明積大制藥有限公司);兔抗人FRAgmA

10、b(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);兔抗大鼠MCP1多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);小鼠抗大鼠的NFBmAb 0.1mL(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);即用型SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);SP9002免疫組化染色試劑盒;VEGF原位雜交檢測試劑盒。1.2方法 健康雄性BN大鼠36只，體質(zhì)量200220g，隨機分為兩組，實驗組和對照組。復(fù)方托品酰胺滴眼液雙眼散瞳，左下ip 100g/L水合氯醛溶液3.0mL/kg麻醉，檢查雙眼前節(jié)和眼底均正常。隨機選取1眼作實驗眼，滴10g/L甲基纖維素后，依照趙世紅等2的方法建立CNV動物模型，另1眼不光凝為正常眼。全身麻醉狀態(tài)下，

11、丁卡因滴眼液表面麻醉后，手術(shù)顯微鏡下，30G針頭顳側(cè)角膜緣后0.5mm作一穿刺口，微量注射器從穿刺口進(jìn)針，大約為1.5mm深，針尖朝向視神經(jīng)方向，玻璃體中可見針尖，緩緩注入TA 8L(320g)，由散大的瞳孔可觀察到玻璃體中TA的白色混懸液體，輕輕拔針后，顯微鑷子輕夾穿刺口片刻，以利穿刺口閉合。對照組BN大鼠玻璃體內(nèi)注射同樣容量的等滲的BSS液。因注射造成晶狀體損傷的眼均被排除實驗。光凝后在 1，2，4wk觀察各實驗指標(biāo)，每組大鼠6只。深度麻醉下摘除眼球，DEPC處理過的蒸餾水沖洗，置于40g/L PFA0.1mol/L PBSDEPC液中固定2h。按病理組織學(xué)方法梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包

12、埋，蠟塊4保存?zhèn)溆?。眼球組織5m厚度連續(xù)切片，置于50 DEPC處理過的蒸餾水中展片，撈片，置烤箱37烤片12h后，4保存，備用做HE染色、免疫組化及原位雜交檢測?？沟馗咝?，37孵育1h;滴加SABC，37孵育30min;生物素化過氧化物酶37孵育20min;AEC室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間;蘇木素復(fù)染20s，充分水洗，GVA水溶性封片劑封片。呈團簇、點狀的紅色著色為陽性。用不含探針的雜交液進(jìn)行雜交作為陰性對照，試劑盒中已知陽性切片作為陽性對照。應(yīng)用ImagePro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)(美國Media cybernetics公司)對NFB，MCP1和FRAg的陽性著色光密度、VEGFmRNA陽性著色光密度進(jìn)行半定量分析。每例標(biāo)本