熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中

1、熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量一、實驗?zāi)康?1.學(xué)習(xí)熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的分析原理；2.掌握熒光分光光度計的操作技術(shù)和測定多維葡萄糖粉中維生素B2的方法。二、實驗原理:1.維生素B2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為： 維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430440 nm藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色熒光，熒光峰在535 nm。維生素B2在pH=67的溶液中熒光強度最大，在pH=11的堿性溶液中熒光消失，所以可以用熒光光度法測維生素B2的含量。葡萄糖中含有維生素B1、B2

2、、C、D2及葡萄糖，其中維生素C和葡萄糖在水溶液中不發(fā)熒光，維生素B1本身無熒光，在堿性溶液中用鐵氰化鉀氧化后才產(chǎn)生熒光，維生素D2用二氯乙酸處理后才有熒光，他們都不干擾維生素B2的測定。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強的多，故測維生素B2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。2.熒光分光光度計 (1)常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長的光而產(chǎn)生熒光。在稀溶液中，熒光強度IF與物質(zhì)的濃度c有以下的關(guān)

3、系： 當(dāng)實驗條件一定時，熒光強度IF與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系： 這是熒光光譜法定量分析的理論依據(jù)。(2)熒光分析法的特點:a.與紫外-可見分光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏度。b.選擇性好。熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來鑒定物質(zhì)。c.所需試樣量少、操作方法簡便。(3)熒光分析儀器a.常用的熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測器和顯示記錄器五部分構(gòu)成，如下圖所示：光源單色器吸收池單色器檢測器 b.熒光分析儀器與分光光度計比較主要差別有兩點：(a)熒光分析儀器采用垂直測量方式，以消除透射光的影響；(b)熒光分析儀器有兩個單色器，能夠獲得單色性較好的激發(fā)光并消除其它雜散光干擾

4、。c.熒光分光光度計工作原理：由光源氙弧燈發(fā)出的光通過切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過單色器變成單色熒光后照射于測樣品用的光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過放大器放大輸至記錄儀，激發(fā)光單色器和熒光單色器的光柵均由電動機帶動的凸輪所控制，當(dāng)測繪熒光發(fā)射光譜時，將激發(fā)光單色器的光柵，固定在最適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長處，而讓熒光單色器凸輪轉(zhuǎn)動，將各波長的熒光強度訊號輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發(fā)射光譜，簡稱熒光光譜。當(dāng)測繪熒光激發(fā)光譜時，將熒光單色器的光柵固定在最適當(dāng)?shù)臒晒獠ㄩL處，只讓激發(fā)光單色口的凸輪轉(zhuǎn)動，將各

5、波長的激發(fā)光的強度訊號輸出至記錄儀，所記錄的光譜即激發(fā)光譜。 當(dāng)進(jìn)行樣品溶液的定量分析時，將激發(fā)光單色器固定在所選擇的激發(fā)光波長處，將熒光單色器調(diào)節(jié)至所選擇的熒光波長處，由記錄儀得出的信號是樣品溶液的熒光強度。三、試劑與儀器:970CRT熒光光度計5 ml吸量管2只，50 ml容量瓶7只, 100 ml容量瓶1只；10.0g/ml維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液，冰乙酸， 多維葡萄糖粉試樣。四、實驗步驟:（一）970CRT熒光光度計基本操作：1.打開氙燈，再打開主機，然后打開計算機啟動工作站并初始化儀器，預(yù)熱30min。2.儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測量項目，設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù)：設(shè)置激發(fā)波長為440

6、nm，發(fā)射波長為540 nm，靈敏度2，入射縫寬和出射縫寬均為10nm。3.點擊“測本底值”，測得本底值為1.41。（二）樣品測定1.標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強度的測定    在62標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入2.00 ml冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。得到不同濃度的溶液分別是：0.1，0.2，0.3，0.5，0.6ug/ml的維生素B2溶液，從稀到濃測量系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強度。2.未知試樣的測定稱取5.0778g多維葡萄糖粉試樣,用少量水溶解后轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，加2.00 ml冰乙酸，稀釋至刻度，搖勻。用測定標(biāo)準(zhǔn)系列時相同的條件，平行測量其熒光強度3次。3.退出主程序，關(guān)

7、閉計算機，先關(guān)主機，最后關(guān)氙燈。五、數(shù)據(jù)處理:1.用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：濃度(g/ml)熒光強度(I)123平均值RSD0.13.8723.8713.8663.8700.0837%0.26.6106.6016.5826.5980.1023%0.39.2239.2379.2039.2210.2112%0.411.45411.37111.46111.4290.2301%0.514.55114.55314.59514.5660.1963%0.616.87316.93016.96516.9230.2014%2.未知樣品濃度的測定    

8、60;            根據(jù)待測液的熒光強度，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得其濃度，計算出試樣中含量。編號123平均值RSDI48.13648.13348.135 48.1350.0033%C/ug.ml-11.7951.7941.794 1.7940.0394%維生素B2百分含量=1.794*100.00/(5.0778*106)*100%=0.0035%六、注意事項:1.使用970CRT時，要按照儀器使用規(guī)定使用，不可隨意操作；2.使用石英比色皿時，要注意勿用手直接觸摸比色皿表面，因握住側(cè)棱。七、思考題:1.試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因?答：熒光強度與激發(fā)光強度成正比，提高激發(fā)光強度，可成倍提高熒光強度。同時，提高儀器靈敏度，也可提高熒光光度法的靈敏度。而對于吸收光度法，無論是提高激發(fā)光強度提高儀器靈敏度還是提高儀器靈敏度，入射光和出射光同時增大，其靈敏度不