生長(zhǎng)激素釋放肽及非肽促泌素的研究應(yīng)用進(jìn)展

1、    生長(zhǎng)激素釋放肽及非肽促泌素的研究應(yīng)用進(jìn)展        摘要目的：介紹90年代發(fā)展起來的新合成生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRPs)及非肽促泌素的研究應(yīng)用進(jìn)展。方法：根據(jù)19901997年有關(guān)文獻(xiàn)，綜述這類新藥的生物活性、作用機(jī)制和藥效學(xué)的研究發(fā)展及其在生命科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。結(jié)果：生長(zhǎng)激素釋放肽-6，生長(zhǎng)激素釋放肽-2，生長(zhǎng)激素釋放肽-1，海沙瑞林以及非肽促泌素MK-0677和L-692，429等均具有顯著的釋放生長(zhǎng)激素的作用和療效。結(jié)論：合成的生物活性肽以生長(zhǎng)激素釋放肽-6和

2、海沙瑞林具有較廣闊的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞生長(zhǎng)激素釋放肽；合成的生物活性肽；非肽促泌素生長(zhǎng)激素釋放肽(growth hormone-releasing peptides,GHRPs)為90年代發(fā)展起來的一類新的合成的生物活性肽，在動(dòng)物和人體中具有釋放生長(zhǎng)激素(growth hormone,GH)的生物活性。非肽生長(zhǎng)激素促泌素(non-peptidyl growth hormone secretagogue)為合成的一類非肽的新化合物，同樣具有促進(jìn)生長(zhǎng)激素釋放的作用。近年來，隨著已知生物活性多肽分子如生長(zhǎng)激素釋放因子(growth hormone releasing factor,GHRF)及有關(guān)同系

3、物的發(fā)展，新的生物活性肽及非肽化合物的研究和應(yīng)用有了新的進(jìn)展。1GHRPs的發(fā)展1982年一種對(duì)動(dòng)物和人的生長(zhǎng)激素分泌有刺激效應(yīng)的非天然生物活性肽首先合成，到1988年開始進(jìn)行臨床試驗(yàn)。此肽由6個(gè)氨基酸組成，氨基酸序列中Trp2和Phe5 (右上角數(shù)字為氨基酸序列的位置，下同)為 D 型氨基酸，稱生長(zhǎng)激素釋放肽-6(GHRP-6)。Majer等1報(bào)道了GHRP類似物在固相載體上的合成方法。此法表明，Lawesson試劑不但可用于在溶液中選擇性的酰胺硫代反應(yīng)，而且可在樹脂的表面進(jìn)行固相合成。在固相合成條件下，C端硫代酰胺是穩(wěn)定的。Prusk等2提出了無載體的電泳分離方法即毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capi

4、llary zone electrophoresis,CZE)和連續(xù)的自由流動(dòng)區(qū)帶電泳(continuous free-flow zone electrophoresis,FFZE)，不但用于GHRPs的微量分析，且可用于其合成的制備型純化。GHRP固相合成法的建立和毛細(xì)管電泳法的純化技術(shù)的應(yīng)用，更促進(jìn)了這類藥物的發(fā)展。近幾年來，隨著GHRP-6動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究的進(jìn)一步發(fā)展，其它新的生物活性肽如不同氨基酸組成的六肽生長(zhǎng)激素釋放肽-2(GHRP-2)，7個(gè)氨基酸組成的生長(zhǎng)激素釋放肽-1(GHRP-1)及GHRP-6中Trp2為D-2-methyl Trp取代的衍生物海沙瑞林(hexarelin

5、,HEXA)以及非肽的生長(zhǎng)激素促泌素如MK-677和L-692，429等相繼合成，并開展了臨床研究35。2GHRPs釋放GH的生物活性2.1GHRP-6在動(dòng)物和人體中釋放GH的作用Walker等6報(bào)告了GHRP-6 po給藥在大鼠、狗和猴子中的生長(zhǎng)激素釋放活性研究和評(píng)價(jià)。大鼠用管飼法po給藥或通過股干線導(dǎo)管非腸道給藥，狗通過頭部靜脈導(dǎo)管iv，食道造口管ig或通過導(dǎo)管通道口十二指腸內(nèi)(id)給藥，大鼠和狗在給藥前后采血測(cè)定血漿中GH濃度。猴子ig從腹部主動(dòng)脈采血測(cè)定血漿中GH的變化，觀察此3種動(dòng)物試驗(yàn)中GHRP-6的腸內(nèi)給藥的活性。大鼠腸內(nèi)和非腸道給藥的ED50分別為4mg.kg-1和25g.k

6、g-1，狗ig和iv給藥的ED50分別為15mg.kg-1和125g.kg-1。猴子對(duì)GHRP-6 id較為敏感，在接受低劑量，如0.3mg.kg-1的ig，血漿中GH增加，ED50為0.75mg.kg-1。研究結(jié)果表明：GHRP-6進(jìn)入腸道可使GH釋放，尤其是長(zhǎng)靈目動(dòng)物，僅需相對(duì)低的劑量即有釋放GH的活性，表明po GHRP-6可實(shí)際治療以代替非腸道給藥的生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)藥物。Nelson等7用神智清醒的狗進(jìn)行了GHRP-6鼻內(nèi)給藥生物活性的評(píng)價(jià)。鼻內(nèi)給藥為劑量相關(guān)地增加血漿中GH水平。劑量為0.25mg.kg-1和0.5mg.kg-1產(chǎn)生GH的水平分別為(11.3±4

7、.8)ng.ml-1和(28.6±8.0)ng.ml-1，給藥后15min達(dá)到峰水平，GH的升高可維持至給藥后105min。用鼻內(nèi)給藥GH時(shí)間-反應(yīng)曲線下的面積(AUC)測(cè)得其生物利用度為34.3%44.9%。研究結(jié)果表明：GHRP-6在狗的鼻內(nèi)給藥具有顯著的活性和好的生物利用度?；诖私Y(jié)果，將可在人體中進(jìn)行評(píng)價(jià)。Hayashi等8用GHRP-6鼻內(nèi)給藥對(duì)6名健康男性志愿者進(jìn)行了血漿中GH、催乳素(PRL)、促黃體生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)、皮質(zhì)甾醇、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-(IGF-)及生長(zhǎng)激素樣免疫反應(yīng)(LI)水平的研究。iv GHRP-6(

8、1g.kg-1體重)導(dǎo)致血漿中GH水平顯著增加。鼻內(nèi)給藥血漿中GH可獲劑量相關(guān)的顯著增加，對(duì)血漿中TSH，LH，F(xiàn)SH，胰島素，血糖及LI水平均無作用。研究表明：正常人體中鼻內(nèi)給藥刺激GH分泌且結(jié)果增進(jìn)IGF的產(chǎn)生。2.2GHRP-2和GHRP-1在人體中釋放GH的活性Bercn等9對(duì)GH缺乏和非GH缺乏但生長(zhǎng)緩慢的兒童及正常對(duì)照兒童進(jìn)行給予GHRP-2和GHRH的研究。結(jié)果各組GHRP-2與GHRH均促進(jìn)了GH釋放，且其GH反應(yīng)峰的比例相似。Laron等10對(duì)GHRP-1在兒童和青少年中GH釋放活性進(jìn)行了研究。結(jié)果全部健康兒童都有進(jìn)行性升高血漿中GH濃度的效應(yīng)，1530min達(dá)到峰濃度。青春

9、期組比青春期前顯示更大的升高(P0.05)。用GHRP-1后，血漿中游離的甲狀腺素顯著升高(P0.01)，促甲狀腺素降低(P0.01)均在正常值限度內(nèi)。GHRP-1也有暫時(shí)升高血漿中皮質(zhì)甾醇濃度的作用(P0.05)。血漿中PRL，LH及FSH濃度不改變。2.3HEXA釋放GH的生物活性Deghenghi等11首先報(bào)告了HEXA對(duì)幼年和成年大鼠的GH釋放活性。出生10d的大鼠給予HEXA，結(jié)果具有刺激GH釋放的強(qiáng)大活性。麻醉的大鼠靜脈注射HEXA，10min即出現(xiàn)釋放GH的峰值水平。scHEXA可使GH長(zhǎng)期釋放。結(jié)論認(rèn)為HEXA為一種高效的GH釋放劑，可用于臨床實(shí)際中的診斷或治療藥物。Cella

10、等12報(bào)道了HEXA對(duì)未麻醉的年輕和老年狗的GH釋放活性的評(píng)價(jià)。對(duì)兩組年齡狗iv HEXA 15.6250g.kg-1，產(chǎn)生劑量依賴的刺激GH分泌的顯著效果。對(duì)HEXA加強(qiáng)GHRH(iv 2g.kg-1)和可樂寧(iv 4g.kg-1)的釋放效應(yīng)，結(jié)果表明：HEXA對(duì)年輕和老年狗均顯著加強(qiáng)GHRH的效應(yīng)，但只對(duì)年輕狗加強(qiáng)了可樂寧的效應(yīng)。2.4非肽促泌素釋放GH的作用合成的非肽促泌素主要的有MK-677和L-692，429。Smith等13報(bào)告了L-692，429的結(jié)構(gòu)鑒定。Cheng等14報(bào)道了L-692，429對(duì)鼠腦垂體細(xì)胞釋放GH的作用。L-692，429刺激大鼠腦垂體前葉細(xì)胞釋放GH是劑

11、量依賴的，其EC50值為60 nmol.L-1。L-692，429產(chǎn)生的GH釋放與GHRP-6釋放GH的最大效應(yīng)相似。Cheng等15又進(jìn)一步對(duì)L-692，429刺激大鼠腦垂體細(xì)胞的作用與GHRP-6及GRF進(jìn)行了比較。研究結(jié)果：L-692，429的EC50為(59.6±7.3)nmol.L-1，在同樣條件下，GHRP-6及GRF的EC50分別為(10.3±19)nmol.L-1及(0.47±0.09)nmol.L-1。L-692，492與GNRP-6均對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平無效應(yīng)。并且再一次表明，L-692，492和GHRP-6釋放最大濃度的數(shù)量相似。3多肽序列及

12、非肽化合物結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系3.1GHRPs釋放GH作用機(jī)制的探索GHRPs釋放GH的生物活性和非肽促泌素保進(jìn)GH分泌的作用，已為多項(xiàng)體外試驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)和人體研究所證實(shí)。但其作用機(jī)制至今仍不清楚。Blake等16用大鼠垂體細(xì)胞以GHRH和GHRP-6進(jìn)行敏感作用研究。GHRH和GHRP-6對(duì)分散的大鼠腦垂體細(xì)胞產(chǎn)生迅速釋放GH的作用。生長(zhǎng)抑素(somatostatin,SRIF)能完全抑制GHRH或GHRP-6的釋放作用，但同時(shí)用GHRH和GHRP-6則SRIF的作用被減弱，不能阻斷GH的分泌。因而認(rèn)為GHRH和GHRP-6的作用是通過不同受體位點(diǎn)，且其分立的信號(hào)使它們對(duì)GH釋放的分別作用被

13、放大。AKman等17研究了GHRP-1在大鼠垂體前葉細(xì)胞的作用機(jī)制。用大鼠垂體腺靜止的單層細(xì)胞培養(yǎng)研究GHRP-1對(duì)cAMP細(xì)胞內(nèi)Ca2+(Ca2+i)GH釋放的效應(yīng)，得出了如下結(jié)論：GHRP-1誘使Ca2+i增加。與GHRH不同，GHRP-1釋放GH是通過Ca2+依賴的和cAMP不依賴的機(jī)制。GHRP-1所致的Ca2+i的增加和釋放GH對(duì)生長(zhǎng)抑素敏感。cAMP的升高劑對(duì)GHRP-1刺激GH釋放有加效性，表明這些生化試劑刺激GH釋放的機(jī)制不同于GHRP-1。McKee18發(fā)表了關(guān)于GHRPs及非肽促泌素通過獨(dú)特受體GH分泌受體(GHS-R)的激活作用。從人和豬的腦垂體腺克隆的GHS-R鑒定為

14、一種第三G蛋白質(zhì)連接受體(GPC-R)控制GH釋放。克隆的鼠GHS-R結(jié)合35SMK-0677有高的親和性解離常數(shù)kd=0.7nmol.L-1。當(dāng)與對(duì)照組織比較時(shí)，尤其是在腦垂體和下丘腦可以觀察到鼠GHS-R的表達(dá)。Ghigo等19研究表明：GHRPs結(jié)構(gòu)與GHRH無同源性，釋放GH是作用于腦垂體或下丘腦上的特定受體，此GHRP受體現(xiàn)已克隆并引起了人們的興趣。就目前所知，它不顯示與其它G-蛋白質(zhì)連接受體順序的同源性，表明存在天然的類GHRP配體GHPRs可能作用于一種未知的下丘腦因子(U因子)。Roh等20研究了GHRP-2時(shí)對(duì)牛腦垂體細(xì)胞的作用機(jī)制，結(jié)果指出：GHRP-2從刺激牛腦垂體細(xì)胞釋

15、放GH。實(shí)際上通過GRF受體作用。由Ca2+通過進(jìn)入Ca2+通道導(dǎo)致GH分泌活性。通過蛋白質(zhì)激酶C和cAMP途徑可增加GH分泌。Bennett等21的研究認(rèn)為，這類合成的GH促泌素(GHSs)是作用于生長(zhǎng)激素促泌素受體(GHS-R)，并研究了此受體的下丘腦表達(dá)和調(diào)節(jié)作用。GHS-R信使核糖核酸(mRNA)是在弓形細(xì)胞核(ARC)和前內(nèi)側(cè)細(xì)胞核(VMN)及海馬中顯著地表達(dá)，ARC和VMN細(xì)胞是為主要的下丘腦靶子，在大鼠中GHS-R可以牽涉GH的反饋調(diào)節(jié)。目前，對(duì)GHRPs釋放GH作用機(jī)制的探索雖尚未揭示其真諦，但為今后的突破性研究提供了有力基礎(chǔ)。3.2GHRPs氨基酸序列與生物活性主要的4種GH

16、RP氨基酸序列比較如下：GHRP-1:Ala-His-D-beta Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2GHRP-2:D-Ala-D-beta Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2GHRP-6:His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2HEXA:His-D-2-methyl Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH24種具有釋放GH生物活性的GHRP，不論是七肽或六肽均具有Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2的氨基酸序列。Smith等認(rèn)為這類肽化合物序列中的芳香族氨基酸如Trp，D-phe及末端的His,Ala,D-Ala對(duì)生物活性

17、是重要的22。GHRP-6和HEXA均含有咪唑(imdazole)和吲哚(indole)結(jié)構(gòu)的氨基酸且氨基酸序列2位和5位均為D型氨基酸(D-Trp2,D-Phe5)。McDowell等22認(rèn)為GHRPs的生物活性主要基于序列中間的芳香族氨基酸和末端的Lys，當(dāng)GHRP-6中His1為D-Ala1所取代，D-Trp2由D-2(2萘基)丙氨酸(D-betaNal)取代時(shí)即為GHRP-2，則生物活性增加。如果保留GHRP-2中的D-beta Nal2而改變D-Ala1為其它氨基酸如Lys或氨基乙二酸則其生物活性降低至數(shù)十分之一至百分之一。Ala3改變?yōu)槠渌被?，生物活性同樣降低?.3非肽促泌素

18、的化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性具有促進(jìn)GH分泌作用的非肽促泌素主要的有MK-0677(式)，L-692，429(式)及L-158432(式)。式和式均具有NHCOCH2C(CH3)2NH2基團(tuán)，式具有NHCOC(CH3)2NH2基團(tuán)。Smith等13指出，L-692，429的相關(guān)化合物如L-158，077，L-692，428結(jié)構(gòu)中也均具有NHCOCH2C(CH3)2NH2基團(tuán)，同樣具有促進(jìn)GH分泌的作用。 4GHRPs和MK-0677的臨床研究及應(yīng)用Kendall-Taylor等23報(bào)告了GHRP對(duì)GH缺乏患者刺激GH分泌的觀察，11例中8例由下丘腦所致的GH缺乏(GHD)和5例中4例由腦垂體所致的GH

19、D患者產(chǎn)生GH大于5mU.L-1，16例中的6例產(chǎn)生GH大于9mU.L-1。Villas-Boas Weffort等24報(bào)告了GHRP-6對(duì)胰島素依賴糖尿病(IDDM)患者釋放GH的作用。6例IDDM患者和7例對(duì)照，每位在分開的3d接受iv GHRP-6 1g.kg-1 GHRH 100g及GHRP-6+GHRH。對(duì)照者和糖尿病患者在給予GHRH或GHRP-6后的GH峰值相似。給予GHRH的GH峰值為(22.5±7.8)至(24.0±9.7)，給予GHRP-6峰值為(20.5±5.3)至(24.4±6.3)。GHRP-6和GHRH合并給藥GH的反應(yīng)對(duì)照者

20、為(70.5±20.0)g*L-1，而糖尿病患者則為(119.0±22.2)g.L-1。Pimentel-Filho等25研究了GHRP-6對(duì)甲狀腺減退患者釋放GH的效應(yīng)。11例甲狀腺減退患者和10位正常者對(duì)照，在分開的3d中隨機(jī)地注射GHRH 100g，GHRP-6 1g.kg-1及GHRH+GHRP-6。結(jié)果：甲狀腺減退患者在GHRH給藥后GH為(4.1±0.9)g.L-1，GHRP-6給藥后GH釋放為(12.6±1.9)g.L-1，正常對(duì)照為(22.1±3.6)g.L-1，說明GHRP-6對(duì)患者GH的釋放比GHRH高。Pihoker等26

21、報(bào)告了GHRP-2噴鼻劑用于矮小身材兒童的治療效果。15名矮小身材兒童，身高低于平均年齡身高的二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差、低增長(zhǎng)速度，骨齡延遲及低的IGF-血清濃度。這些兒童均曾用GH促分泌試驗(yàn)證實(shí)。研究結(jié)果表明GHRP-2噴鼻給藥具有良好的耐受性且產(chǎn)生適度而顯著的，增加生長(zhǎng)速度。Laron等27報(bào)告了HEXA加速矮小兒童生長(zhǎng)的治療效果。8名青春前的矮孩子年齡為411.6歲進(jìn)行鼻內(nèi)給藥，劑量為60g.kg-1，每日3次，治療8個(gè)月。結(jié)果：HEXA刺激IGF-分泌使IGF-水平從(10.4±4.6)nmol.L-1提高至(14.1±4.6)nmol.L-1(P0.004)，IGF-的升高引起

22、平均線性生長(zhǎng)速度的有效增長(zhǎng)從每年(5.3±0.8)cm至(8.3±1.7)cm(P0.0001)，說明HEXA鼻內(nèi)給藥能達(dá)到合成代謝及促進(jìn)生長(zhǎng)的效果，無副反應(yīng)，建議臨床應(yīng)用。Ghigo等28報(bào)道了HEXA短期鼻內(nèi)或po恢復(fù)老年人衰退的GH釋放的抗衰老效果。研究為7位老年人(4名男性，3名女性6780歲)，8d鼻內(nèi)給藥HEXA 1.25mg(約1.8g.kg-1)，一日3次。研究為7名老年婦女(6380歲)po HEXA 20mg(約300g.kg-1)，一日3次，15d前及15d后測(cè)定IGF-,IGF-與蛋白質(zhì)-3(IGFBP-3)結(jié)合，PRL與皮質(zhì)甾醇的水平。服用8d，可

23、保持GH增加的傾向，且IGF-1及IGFBP-3水平有效地增加，PRL或皮質(zhì)甾醇水平不改變且不產(chǎn)生任何副反應(yīng)。因此Ghigo等認(rèn)為，長(zhǎng)期但間歇鼻內(nèi)或po HEXA，可使衰老中降低的GH釋放得到有效的恢復(fù)，從而發(fā)揮GH的生理作用，達(dá)到抗衰老的效果。Chapman等29報(bào)告了在選擇的GH缺乏的成年人中MK-0677的作用。9例幾種GH缺乏男性成年患者，胰島素導(dǎo)致的低血糖血清GH峰濃度(1.2±1.5)g.L-1，平均身高偏差為0.024.79cm，年齡1734歲，身高(168±1.5)cm體質(zhì)指數(shù)(22.6±3.5)kg.m2，童年時(shí)曾用GH治療GH缺乏者進(jìn)行了研究。

24、在設(shè)計(jì)的雙盲劑量升高，主體接受每日po劑量MK-0677 10mg或50mg或安慰劑，4d經(jīng)2個(gè)療程至少28d。在1期和2期4名主體接受安慰劑和MK-0677 10mg.d-1交叉進(jìn)行。5位主體在1期和2期以連續(xù)提高劑量方式接受MK-0677 10mg.d-1，然后為50mg.d-1。在治療前24h每20min采血并在每周期末用紫外分光光度法測(cè)定GH濃度。皮質(zhì)甾醇、PRL和甲狀腺激素循環(huán)濃度沒有顯著改變。所有的主體在用MK-0677 10mg.d-1及50mg.d-1治療后血清IGF-及24h平均GH濃度均較基線增加，用MK-0677 10mg治療后，IGF-增加(52±20)%(6

25、5±6)至(99±9)g.L-1，P或=0.05及24h平均GH濃度增加(79±19)%(0.14±0.01)至(0.26±0.02)g.L-1，P或=0.05。用MK-0677 50mg.d-1治療后，IGF-濃度增加(79±9)%(84±3)至(150±6)g.L-1，P或=0.05及24h平均GH濃度增加(82±29)%(0.21±0.02)至(0.39±0.04)g.L-1，P或=0.05。研究表明：MK-0677對(duì)兒童時(shí)期發(fā)作的GH缺乏有療效。5結(jié)語(yǔ)近幾年發(fā)展起來的具有釋放G

26、H活性的一類生長(zhǎng)激素釋放肽和促進(jìn)GH分泌的非肽生長(zhǎng)激素促泌素，尤其是GHRP-6，HEXA及MK-0677由于po或鼻內(nèi)給藥有效，因而使其在促進(jìn)GH缺乏兒童的生長(zhǎng)和恢復(fù)老年人的GH分泌，延緩衰老等生命科學(xué)領(lǐng)域中獲得了應(yīng)用。這類藥物的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用將為生命科學(xué)新領(lǐng)域的研究和促進(jìn)人類健康開拓廣闊的前景。作者單位：陳執(zhí)中 (上海200032上海醫(yī)科大學(xué))參考文獻(xiàn)1Majer Z,Zawdu M,Hollosi M,et al.Solid phase sysnthesis of a GHRP analog containing C-terminal thioamide group.Biochem B

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