一種生物素改性聚乳酸生物材料的制備與性能研究

1、一種生物素改性聚乳酸生物材料的制備與性能研究*嚴(yán)好,潘君,江偉民,張曉喜,王遠(yuǎn)亮(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院生物材料與仿生工程中心,生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400030摘要:研究試圖通過(guò)本體改性,將生物素接枝到聚乙二醇接枝聚乳酸(P P L A上,以改善聚乳酸微球在藥物緩釋?xiě)?yīng)用中血液循環(huán)時(shí)間短和無(wú)主動(dòng)靶向性的缺點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)室制備的聚乙二醇接枝改性聚乳酸的基礎(chǔ)之上,采用N-羥基琥珀酰亞胺活化酯法,將生物素接枝到P P L A上,制備生物素改性聚乳酸(B P L A。通過(guò)茚三酮顯色、核磁共振(1H-NMR,差示掃描量熱(D S C,靜態(tài)水接觸角、熒光蛋白標(biāo)記法對(duì)材料進(jìn)行表征與檢測(cè)。結(jié)果表

2、明,生物素已經(jīng)共價(jià)接枝到聚乳酸上;與P P L A相比,B P L A明顯降低了對(duì)牛血清白蛋白(B S A的吸附,有望提高聚乳酸微球在血液循環(huán)系統(tǒng)中的停留時(shí)間;同時(shí)能與生物素的配體親和素結(jié)合,有望通過(guò)生物素和親和素的高親和性實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向,可能使B P L A在藥物緩釋中有潛在應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞:聚乳酸;生物素;親和素;生物活性;藥物緩釋中圖分類(lèi)號(hào):R318.08文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1001-9731(201103-0399-051引言自20世紀(jì)20年代開(kāi)始,聚乳酸(P L A作為一種聚酯類(lèi)纖維廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,它具有良好的生物相容性,生物降解性和可吸收性,是經(jīng)F D A批準(zhǔn)應(yīng)用的可降解合

3、成高分子材料1。近年來(lái),P L A及其共聚物被用作一些半衰期短,穩(wěn)定性差、易降解及毒副作用大的藥物控釋制劑的可溶蝕性基材2,該技術(shù)的使用有效地拓寬了給藥途徑,減少了給藥次數(shù)和給藥量,提高了藥物的生物利用度,減少了藥物對(duì)全身特別是肝腎的毒副作用。然而應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)P L A在體內(nèi)易吸附蛋白質(zhì)等物質(zhì),致使P L A微球易被體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(R E S清除3。此外,P L A不具有可與靶器官特異性結(jié)合的性能,即不具有主動(dòng)靶向性4。為進(jìn)一步提高藥物的生物利用度,降低P L A對(duì)蛋白質(zhì)等物質(zhì)的吸附,研究者們將聚乙二醇(P E G鏈接到P L A上,制備了P L A-P E G嵌段共聚物5。為了賦予P L

4、A比較好的抗非特異性蛋白的吸附性能,研究者們通常選擇的P E G分子量都>2000,甚至大于50006。由于P E G分子在體內(nèi)不易降解7,本實(shí)驗(yàn)選用分子量為500的P E G,通過(guò)接枝的方式接到P L A 上,制備了P E G接枝P L A。研究結(jié)果顯示,P E G接枝P L A有很好的抗非特異性蛋白吸附性能8。為賦予P L A主動(dòng)靶向性,研究者們將可與靶器官特異性結(jié)合的抗體或者配體接到P L A上。目前常用的將抗體或者配體接到聚合物上的方式有兩種:(1直接共價(jià)結(jié)合抗體或者配體9,10。這種方式有可能會(huì)破壞聚合物的主鏈結(jié)構(gòu),使得聚合物更易被降解;也有可能破壞抗體或配體的化學(xué)結(jié)構(gòu),使得抗

5、體或配體的生物活性降低或喪失,從而降低或喪失聚合物的靶向性;(2通過(guò)生物識(shí)別將抗體或配體結(jié)合到聚合物上9。這種方式的反應(yīng)條件溫和,可很大程度地保留抗體或配體的生物活性。目前最常用到的生物識(shí)別系統(tǒng)是生物素和親和素。天然存在的生物素為d型,其分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。它依靠分子中的咪唑酮環(huán)能與親和素進(jìn)行特異性結(jié)合,而噻吩環(huán)側(cè)鏈末端的羧基則可共價(jià)結(jié)合其它基團(tuán)或分子。親和素是一種糖蛋白質(zhì),分子量為60k D。一個(gè)親和素分子能夠和4個(gè)生物素分子高特異性結(jié)合(K d=10-1511,12,同時(shí)抗體或者蛋白質(zhì)通過(guò)與生物素分子上的羧基結(jié)合被生物素化后仍保留了與親和素的高親和性,而這種生物素化的抗體或蛋白質(zhì)比較容易合成1

6、3,且已有很多商業(yè)化的產(chǎn)品 。圖1生物素結(jié)構(gòu)圖F i g1T h es t r u c t u r eo fb i o t i n本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)上,采用N-羥基琥珀酰亞胺活化酯法,將生物素共價(jià)接枝到P P L A中,以制備生物素化的P L A,進(jìn)而可能利用生物素與親和素的高親和性,將生物素化的抗體或者配體鏈接到P L A 上,制備生物活性的聚乳酸。研究采用茚三酮顯色、核磁共振、差示掃描量熱、水接觸角、熒光標(biāo)記技術(shù)證明了生物素化聚乳酸的成功合成,并顯示出良好的抗非特異性蛋白吸附和與親和素結(jié)合的性能。993嚴(yán)好等:一種生物素改性聚乳酸生物材料的制備與性能研究*基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金

7、資助項(xiàng)目(10972243收到初稿日期:2010-07-08收到修改稿日期:2010-08-09通訊作者:潘君作者簡(jiǎn)介:嚴(yán)好(1985-,男,重慶人,碩士,師承潘君研究員,從事生物材料研究。2實(shí)驗(yàn)2.1實(shí)驗(yàn)試劑聚乳酸(D,L-P L A,平均分子量:5萬(wàn),M w/M n= 1.4:實(shí)驗(yàn)室自制;馬來(lái)酸酐(MA,四氫呋喃(T H F,過(guò)氧化二苯甲酰(B P O,二甲基亞砜,二甲基甲酰胺(D M F,乙醚,乙醇,水合茚三酮,異丙醇:市售分析純;氨基封端聚乙二醇(P E G,分子量500,F I T C-B S A:S i g m a公司;生物素,F I T C-親和素,N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(D

8、C C,N-羥基琥珀酰亞胺(NH S: P i e r c e公司;雙蒸水:M i l l i p o r e。2.2P P L A材料的制備參照文獻(xiàn)14制備材料P P L A,現(xiàn)簡(jiǎn)述如下。2.2.1馬來(lái)酸酐改性聚乳酸(M P L A的制備取P L A、MA、B P O按一定比例用T H F溶解后混合均勻,迅速放真空干燥箱中室溫真空干燥至溶劑徹底揮發(fā);把干燥好的材料放真空干燥箱中,100真空反應(yīng)10h,然后迅速降至室溫,將制備的M P L A取出備用。2.2.2P E G改性M P L A(P P L A的制備將制備好的M P L A用T H F溶解,按照其中MA 的量取H2N-P E G-N

9、H2置于圓底燒瓶中,攪拌條件下把M P L A溶液逐滴滴加到圓底燒瓶中,滴加完后油浴5055保溫2h。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)T H F-水體系純化。將產(chǎn)物在室溫下真空干燥,得到產(chǎn)物P P L A。2.3生物素改性聚乳酸材料(B P L A的制備由于P P L A中含有C O O H和NH2兩種活性基團(tuán),生物素中只含有一個(gè)C O O H活性基團(tuán),我們采用N-羥基琥珀酰亞胺活化酯法分兩步將生物素與P P L A偶聯(lián):首先將生物素,N-羥基琥珀酰亞胺與N, N-二環(huán)己基碳二亞胺混合,使之反應(yīng)生成N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯(B NH S;然后用B NH S與含氨基的P P L A反應(yīng)制備出生物素改性的P P L

10、 A(B P L A,反應(yīng)原理見(jiàn)圖2 。圖2B P L A反應(yīng)原理圖F i g2T h er e a c t i o ns c h e m eo fB P L A反應(yīng)先將生物素,NH S和D C C按物質(zhì)的量之比為133溶于D M F,室溫下磁力攪拌24h;根據(jù)文獻(xiàn)15所提供的提純方法,離心除去沉淀(D C U;將上清液用過(guò)量乙醚沉淀;取出白色沉淀用異丙醇重結(jié)晶4次,真空干燥24h得到白色晶體B NH S。然后按照P P L A中氨基與B NH S物質(zhì)的量為11的比例溶于D M F中,磁力攪拌下40反應(yīng)72h,用D M F-水體系提純,收集水面上的膜,真空干燥48h得到B P L A。2.4B

11、 P L A的表征與性能測(cè)試2.4.1茚三酮顯色稱(chēng)取一定量的P P L A和B P L A,分別加入適量混合溶劑(異丙醇和二甲亞砜體積比11和茚三酮溶0 0 42011年第3期(42卷液(0.1m o l/L的乙醇溶液,水浴85保溫15m i n,用紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(P e r k i n E l m e rL a m b d a900檢測(cè)在570n m的吸光值。2.4.2核磁共振以氘代氯仿(C D C l3為溶劑,四甲基硅烷(TM S為內(nèi)標(biāo),用核磁共振波譜儀(B r u k e rA V5000m o d e l測(cè)定P P L A,B P L A的1H-NMR譜圖。2.4.3差示掃描量

12、熱用差示掃描量熱計(jì)(W a t e rT AQ200m o d e l測(cè)試P P L A、B P L A聚合物的熱性能。溫度范圍080,升溫速率5/m i n,氣氛為氬氣。2.4.4靜態(tài)水接觸角將P P L A和B P L A的乙酸乙酯溶液滴在蓋玻片上,溶劑揮發(fā)48h成膜。用接觸角測(cè)量?jī)x(臺(tái)灣翰光高科技股份有限公司測(cè)定兩種材料的靜態(tài)水接觸角。2.4.5非特異性吸附為檢測(cè)材料對(duì)蛋白的非特異性吸附作用,考慮到血清白蛋白為體內(nèi)主要的非特異性蛋白,我們以牛血清白蛋白(B S A為模型蛋白,測(cè)試了材料對(duì)B S A的吸附,操作如下:(1鋪膜:取8個(gè)直徑為35m m的培養(yǎng)皿,其中4個(gè)每個(gè)加入6m gP P

13、L A,另外4個(gè)每個(gè)加入6m gB P L A,然后分別加2m L乙酸乙酯溶解。為了同時(shí)測(cè)試濕度對(duì)結(jié)果的影響,將含P P L A的2個(gè)培養(yǎng)皿和含B P L A的2個(gè)培養(yǎng)皿在室溫干燥條件下?lián)]發(fā)96h 成膜,其余的置于室溫(20潮濕條件(相對(duì)濕度100%下成膜。(2孵育:分別取濃度為0.02m g/m L 的F I T C-B S A溶液3m L置于8個(gè)培養(yǎng)皿中,在37條件下靜態(tài)孵育30m i n。移走上清液,用雙蒸水清洗掉未結(jié)合到材料上的F I T C-B S A,直至清洗液中不含F(xiàn) I T C-B S A(通過(guò)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。(3檢測(cè):用3m LT H F將聚合物及表面的F I T C-B

14、 S A溶解,用熒光分光光度計(jì)(P e r k i n E l m e rL S-50B以490n m的光激發(fā),測(cè)試樣品在510n m處的發(fā)射光強(qiáng)度。2.4.6特異性吸附為檢測(cè)材料對(duì)生物素的配體親和素的特異性吸附作用,我們測(cè)試了材料對(duì)親和素的吸附。操作步驟見(jiàn)2.4.5,只是將其中的F I T C-B S A換成F I T C-親和素。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1茚三酮顯色結(jié)果及分析由于氨基與茚三酮共熱可生成藍(lán)紫色的化合物,該化合物的顏色深淺與氨基的含量成正比,可根據(jù)570n m處的吸光值,測(cè)定氨基的含量。本實(shí)驗(yàn)中,B P-L A的吸光值為0,而P P L A的吸光值為正,定性地說(shuō)明了P P L A中的氨基

15、全部與B NH S反應(yīng)。證明生物素已經(jīng)接枝到P P L A鏈上。3.2核磁共振測(cè)定結(jié)果及分析圖3是核磁共振氫譜圖。a處是聚乳酸主鏈上的次甲基峰,b和c處是生物素分子上與NH相連的次甲基峰,f處是生物素分子上與S相連的次甲基峰,e,h 是聚乙二醇分子上的亞甲基峰,i是主鏈上的甲基峰,g 是生物素分子上與S相連的亞甲基峰,d是聚乙二醇上的次甲基峰。通過(guò)峰的積分?jǐn)?shù)據(jù)我們計(jì)算,生物素的接枝率大約為0.99% 。圖3核磁共振氫譜圖F i g31H-NMRS p e c t r ao fP P L Aa n dB P L A1 0 4嚴(yán)好等:一種生物素改性聚乳酸生物材料的制備與性能研究3.3差示掃描量熱結(jié)

16、果與分析 圖4是差示掃描量熱圖譜。P P L A 的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為25.3,而B(niǎo) P L A 的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為30.7,生物素的引入增加了材料的剛性,故B P L A 的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較P P L A 高。由于B P L A 和P P L A 都只有一個(gè)玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,因此我們認(rèn)為提純方法是有效的,得到的是純凈的產(chǎn)物。 圖4差示掃描量熱圖譜F i g 4D S C S p e c t r a o f P P L A a n d B P L A 3.4水接觸角結(jié)果分析生物素的結(jié)構(gòu)決定了它的親水性比氨基差,如果在P P L A 材料中引入了生物素,B P L A 的疏水性將提高,表現(xiàn)為水接觸角

17、的增大。圖5是水滴在P P L A 表面和B P L A 表面的照片。 圖5接觸角圖像F i g 5C o n t a c t a n g e l s p e c t r u m o f s a m p l e s 水在PP L A 表面迅速鋪展開(kāi),接觸角小到儀器的檢測(cè)限外,B P L A 表面的水形成小液珠,B P L A 接觸角明顯大于P P L A 。經(jīng)測(cè)定,B P L A 的平均接觸角為66°,肉眼觀察P P L A 的接觸角不到10°。接觸角的顯著差別體現(xiàn)了兩種材料表面性質(zhì)的差異,進(jìn)一步證明了本實(shí)驗(yàn)條件下,生物素已經(jīng)被成功引入到P P L A 中。3.5吸附結(jié)果與

18、分析根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到B S A 和親和素在材料表面的結(jié)合量,見(jiàn)表1。表1B S A 、親和素在材料表面的結(jié)合量T a b l e 1T h e a m o u n t o f F I T C -B S A a n d F I T C -a v i d i n ab s o r b e d o n P P L A a n dB P L A 吸附量(m g /m 2B S A親和素B P L A P P L A B P L A P P L A 干燥1.543.081.250.742潮濕1.512.681.190.668根據(jù)表1的結(jié)果,可以看出,(1B P L A 吸附B S A 的量

19、約是P P L A 的1/2。由于前期研究已經(jīng)證明P P -L A 具有抗非特異性蛋白吸附能力8,因此,B P L A 具有比P P L A 更強(qiáng)的抗非特異性吸附能力;(2B P L A 吸附親和素的量是P P L A 的約2倍,證明生物素分子已被引入材料中,且生物素可以與親和素結(jié)合,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程沒(méi)有破壞生物素的活性;(3對(duì)比B P L A 和P P L A對(duì)親和素和B S A 的吸附,說(shuō)明了B P L A 對(duì)親和素具有特異性的吸附能力,有望成為制備生物活性聚乳酸材料的前體,通過(guò)生物素-親和素系統(tǒng)引入生物活性物質(zhì)。4討論本實(shí)驗(yàn)將生物素共價(jià)接枝到聚乳酸上,制備了B P L A 材料,與P P L

20、 A 相比,它具有更明顯的抗非特異性吸附性能,同時(shí)能與生物素的配體親和素結(jié)合,顯示出特異性的吸附性能。本研究所描述的向P P L A 中共價(jià)引入生物素的技術(shù)不同于已報(bào)道的表面化學(xué)改性技術(shù)。材料的表面改性有時(shí)會(huì)隨著材料的降解使得改性獲得的性質(zhì)隨之消失14。本研究的目的不僅是制備一種新型的含生物素的生物活性材料,更重要的是探索一種能夠在降低非特異性蛋白吸附的條件下,向生物材料本體(而不僅是表面共價(jià)引入蛋白質(zhì)、多肽等生物活性分子的制備技術(shù)。這為根據(jù)需要向P P L A 中引入其它蛋白質(zhì)、多肽等藥物,形成具有全面生理功能的藥物緩釋材料奠定了基礎(chǔ)。文獻(xiàn)報(bào)道中采用偶聯(lián)方式將生物素接到聚乳酸末端9,16。先

21、將生物素接枝到P EG 的末端,然后通過(guò)P L A 與生物素化的P E G 反應(yīng)使生物素接在材料主鏈末端。本實(shí)驗(yàn)中采用接枝的方法,將生物素共價(jià)接枝到改性P L A 的P E G 側(cè)鏈上。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件,提高P E G 的接枝率,從而可以提高生物素在P L A 上的接枝率,使一條主鏈不只接上一個(gè)生物素分子。同時(shí)也有報(bào)道先將親和素接在聚合物上4,通過(guò)生物素-親2042011年第3期(42卷和素系統(tǒng),將生物素化的靶向識(shí)別分子接到材料上,賦予其主動(dòng)靶向性。本實(shí)驗(yàn)中選用將生物素接到材料上,是考慮到生物素比親和素分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,并且活化之后能與氨基比較容易地反應(yīng),反應(yīng)部位能很好地控制,且反應(yīng)后能維持與親和

22、素的結(jié)合性能。核磁共振和吸附實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明生物素的接枝率不高,這可能是P P L A 鏈上的C O O H 與NH 2形成內(nèi)鹽影響了生物素的接枝率,因此有待我們繼續(xù)改進(jìn)反應(yīng)條件;但我們應(yīng)該注意到,生物體內(nèi)的某些活性物質(zhì)在量很少的時(shí)候,也能夠通過(guò)生物的逐級(jí)放大過(guò)程而引起大的生物響應(yīng),因此從這方面考慮,也不需要很大的接枝率。我們分別測(cè)試了不同濕度下蛋白的吸附。發(fā)現(xiàn):(1潮濕環(huán)境中成膜的吸附量略小于干燥環(huán)境下的。這很可能是因?yàn)槌睗癍h(huán)境下成膜時(shí)親水的P E G 分子在材料表面的伸展程度更好。(2B P L A 和P P L A 吸附B S A 的量均大于吸附親和素的量,分析原因可能是由于實(shí)驗(yàn)條件的影響

23、。本實(shí)驗(yàn)使用的雙蒸水室溫時(shí)pH 值為6.5,F I T C -親和素的等電點(diǎn)為6,F I T C -B S A 的等電點(diǎn)為4.8。在蒸餾水中,F I T C-親和素幾乎不帶電荷,而F I T C -B S A 則帶有部分負(fù)電荷。由于P P -L A 中含有的氨基帶部分正電荷,通過(guò)電荷相互作用,可以吸附更多的B S A ,使得B S A 吸附性能更好。由于一個(gè)親和素分子能夠與4個(gè)生物素分子進(jìn)行特異性的結(jié)合,生物素又是某些細(xì)胞中存在的物質(zhì)17,18,我們預(yù)計(jì),B P L A 通過(guò)與親和素結(jié)合,可與某些細(xì)胞進(jìn)行特異性的結(jié)合,以期望到達(dá)特定的目標(biāo)。因此,B P L A 有望在靶向藥物緩釋系統(tǒng)領(lǐng)域得到應(yīng)

24、用。5結(jié)論通過(guò)N -羥基琥珀酰亞胺活化酯法,將生物素接枝到P E G 接枝聚乳酸(P P L A 上,對(duì)P P L A 進(jìn)行本體改性。茚三酮顯色、核磁共振,差示掃描量熱,靜態(tài)水接觸角以及熒光蛋白吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,與P P L A 相比,B P L A 能抗非特異性蛋白吸附,且可與生物素的配體親和素結(jié)合。參考文獻(xiàn):1M o o n e y D J ,P a r k S ,K a u f m a n n P M ,e t a l .J .J B i o m e d M a t e r R e s ,1995,29:959-965.2P a r k S J ,C h o i S H ,Y o o n

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27、635-641.10D r u m h e l l e r P D ,H u b b e l l J A.J .A n a l B i o c h e m ,1994,222:380-388.11L i n d q v i s t Y ,S c h n e i d e r G.J .C u r r O pi n S t r u c B i o l ,1996,6:798-803.12G r e e n N M.J .B i o c h e m J ,1965,94:23.13C a n n i z z a r o S M ,P a d e r a R F ,L a n ge r R ,e t

28、a l .J .J B i -o m e d M a t e r R e s ,1998,58:529-535.14P a n J ,W a n g Y L ,Q i n S H ,e t a l .J .J B i o m e d M a t e r R e s ,2005,74B :476-480.15徐常龍,嚴(yán)平,王琳,等.J .化工中間體,2007,1:19-20.16S a l e m A K ,C a n n i z z a r o S M ,D a v i e s M C ,e t a l .J .B i o -m a c r o ,2001,2:575-580.17R o d

29、r i g u e z -M e l e n d e z R ,Z e m pl e n i J .J .J N u t r i B i o -c h e m ,2003,14:680-690.18Z e m pl e n i J ,M o c k D M.J .J N u t r i B i o c h e m ,1999,10:128-138.T h e p r e p a r a t i o n a n d p r o p e r t y o f a p o l y (l a c t i c a c i d b i o m a t e r i a l m o d i f i e d b

30、y b i o t i n Y A N H a o ,P A N J u n ,J I A N G W e i -m i n ,Z HA N G X i a o -x i ,WA N G Y u a n -l i a n g(T h e K e y L a b o r a t o r y o f B i o r h e o l o g y S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y u n d e r M i n i s t r y o f E d u c a t i o n ,B i o m a t e r i a l s a n d I n s p i

31、r e d E n g i n e e r i n g C e n t e r ,C o l l e g e o f B i o l o g i c a l E n g i n e e r i n g ,C h o n g q i n g U n i v e r s i t y ,C h o n g q i n g 400030,C h i n a A b s t r a c t :T h e a i m o f t h i s r e s e a r c h i s t o o v e r c o m e t h e d r a w b a c k s o f P L A i n d r u

32、 g d e l i v e r y s y s t e m ,w h i c h a r e s h o r t b l o o d c i r c u l a t i o n t i m e a n d n o n -a c t i v e t a r g e t i n g .B a s e d o n P E G -g r a f t -P L A (P P L A d e v e l o pe d i n o u r l a b ,b i o t i n w a s g r af t e d o n t o P L A t o p r o d u c e B P L A b yNH

33、S -a c t i v a t e d m e t h o d .T h e n i n h y d r i n c o l o r a t i o n ,1H -NMR ,D S C ,w a t e r c o n t a c t a n g l e t e s t ,f l u o r e s c e n c e l a b e l e d p r o t e i n a b s o r p t i o n t e s t w e r e u s e d t o c h a r a c t e r i z e B P L A.R e s u l t s f r o m n i n h y d r i n c o l o r a