T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的動力學(xué)分析

1、T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的動力學(xué)分析 09-08-28 08:58:00 編輯：studa20 作者：劉順會 肖蘭鳳 黃樹林【摘要】 目的：建立T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的動力學(xué)模型，通過模型仿真揭示T細(xì)胞受體信號途徑各分子間的動態(tài)調(diào)控過程，簡要分析模型的動力學(xué)特性。方法：根據(jù)數(shù)據(jù)庫KEGG及相關(guān)中英文文獻(xiàn)，提取T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)各條通路相關(guān)分子作用的方式及數(shù)量關(guān)系，利用Matlab7.0的Simulink工具箱構(gòu)建信號途徑的動力學(xué)模型并仿真。結(jié)果：模型仿真結(jié)果與文獻(xiàn)符合得較好，能夠從數(shù)量上反映T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中各分子間復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，并能通過模型仿真發(fā)現(xiàn)和驗證該信號途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子。結(jié)論

2、：模型基本反映了T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的動力學(xué)特征，可以作為后續(xù)的精確定量關(guān)系研究的基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 T細(xì)胞受體； 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)； 動力學(xué)模型T細(xì)胞特異性抗原或TCR/CD3的特異性抗體可引起T細(xì)胞跨膜受體以及膜附近的其它信號分子的活化，并引起T細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞粘附性改變等免疫應(yīng)答，從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖、分化或凋亡，該過程涉及一系列下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控。T細(xì)胞活化時信號傳遞由T細(xì)胞表面抗原識別受體（T cell receptor, TCR）介導(dǎo)，外來信號經(jīng)受體及相關(guān)蛋白傳遞給胞內(nèi)的蛋白酪氨酸激酶，此后啟動三條下游信號途徑：一為磷脂酶C-1（Phospholipase-C1，

3、PLC-1）介導(dǎo)的信號途徑，二為Ras-MAPK途徑，三為共刺激分子介導(dǎo)的磷酸肌醇激酶-3（PI3K）輔助信號途徑。同時，為保持免疫應(yīng)答的平衡，避免過度活化，T細(xì)胞的活化過程還受到抑制性信號通路的調(diào)節(jié)，這些通路彼此交織，構(gòu)成一個十分復(fù)雜的T細(xì)胞活化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)1。 隨著各種復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中各個分子通道的確定，如何從系統(tǒng)水平上定量地分析各信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)特征就成為當(dāng)前系統(tǒng)生物學(xué)的研究重點(diǎn)。除各種并行、高通量的實驗技術(shù)外，數(shù)學(xué)建模和仿真是另外一種研究復(fù)雜生化網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)有力手段，比如在細(xì)胞代謝研究領(lǐng)域已經(jīng)很廣泛地利用數(shù)學(xué)模型分析具有多個調(diào)控環(huán)的代謝網(wǎng)絡(luò)2。實踐表明，通過建立生化網(wǎng)絡(luò)的數(shù)學(xué)模型并進(jìn)行計

4、算機(jī)仿真能夠擬合現(xiàn)有的實驗數(shù)據(jù)，解釋實驗中觀測到的現(xiàn)象，預(yù)測一些不能通過當(dāng)前實驗手段獲得的結(jié)果，減少實驗的強(qiáng)度和數(shù)量，并驗證實驗提出的可能機(jī)制。 本研究建立了T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的動力學(xué)模型，通過模型仿真揭示了T細(xì)胞受體信號途徑各分子間的動態(tài)調(diào)控過程，并對模型的動力學(xué)特性進(jìn)行了簡要分析。 1 材料與方法 1.1 T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（圖1）摘自KEGG數(shù)據(jù)庫（http:/www.genome.jp/kegg/）。本研究根據(jù)相關(guān)中英文文獻(xiàn)，對圖中涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子之間的作用方式及數(shù)量關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)研究和確證，并據(jù)此定義整個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的變量（包括自變量和因變量）和

5、變量之間的關(guān)系。 1.2 動力學(xué)建模 本研究采用S-系統(tǒng)方程（S-system equations）2來描述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生化級聯(lián)反應(yīng)過程。對于含有n個因變量X1，X2，Xn（其數(shù)量隨時間而變化）和m個自變量Xn+1, Xn+2, ，Xn+m（一般設(shè)定為某些不變常量）的生化級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，其動力學(xué)時變方程可以表達(dá)為： dXi / dt=V+i-V-i i = 1, 2, , n(1) 式中Xi的生產(chǎn)函數(shù)Vi+ = Vi+ (X1，Xn，Xn+1, ，Xn+m)和消耗函數(shù)Vi- = Vi- (X1，Xn，Xn+1, ，Xn+m)是所有變量的函數(shù)，式（1）用S-系統(tǒng)方程可表達(dá)為： dXi / dt=i

6、n+m j=1Xgijj-i n+m j=1Xhijj i = 1, 2, , n(2) 式（2）中i和i（i、i 0）分別表示生產(chǎn)函數(shù)和消耗函數(shù)的速率常數(shù)，gij和hij分別表示變量Xj在因變量Xi的生產(chǎn)和消耗過程中的動力學(xué)階，其中g(shù)ij或hij 0表示Xj在Xi的生產(chǎn)或消耗過程中起正調(diào)控作用，反之，如果gij或hij 0則表示Xj在Xi的生產(chǎn)或消耗過程中起“負(fù)”調(diào)控作用，而當(dāng)gij或hij= 0時則表示Xj在Xi的生產(chǎn)或消耗過程中不起任何調(diào)控作用。 Note: Based on KEGG database (http:/www.genome.jp/kegg/) 圖1 T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

7、 為簡便起見，本研究以一個范例來概要整個建模過程。圖2顯示了經(jīng)典的帶有“正” “負(fù)”調(diào)控作用的信號級聯(lián)反應(yīng)過程。級聯(lián)反應(yīng)中前體X3、X4通過兩步反應(yīng)（比如磷酸化）衍生出活性產(chǎn)物X1、X2，其中上一級反應(yīng)產(chǎn)物影響下一級反應(yīng)。該級聯(lián)反應(yīng)由系統(tǒng)輸入X5啟動，而當(dāng)終產(chǎn)物X2足夠多時，則通過負(fù)反饋?zhàn)饔靡种芚1的生成，從而整個過程得以減緩。 Note: positive regulation; negetive regulation 圖2 帶有反饋的兩步級聯(lián)反應(yīng) 該過程中X1、X2是因變量，而X3 X5則被認(rèn)為是自變量，其動力學(xué)用S-系統(tǒng)方程可表達(dá)為： dX1 / dt=1Xg122 Xg133 Xg15

8、5-1Xh111 dX2 / dt=2Xg211 Xg244-2Xh222 (3) X3,X4,X5=常數(shù) 由于式（3）中前體X3、X4是常數(shù)，其對X1、X2生產(chǎn)函數(shù)的貢獻(xiàn)可以分別歸并為速率常數(shù)1、2，因此為避免估計更多參數(shù)，可以不考慮活性產(chǎn)物前體的作用（但又不影響分析結(jié)果），式（3）可改寫為： dX1 / dt=1Xg122 Xg155-1Xh111 dX2 / dt=2Xg211 -2Xh222 (4) 與上述范例類似，本研究對T細(xì)胞受體信號途徑的動力學(xué)模擬一律不考慮活性產(chǎn)物的前體，而只研究活性產(chǎn)物受到的“正”“負(fù)”調(diào)控作用。事實上，圖1所示即是不考慮前體分子的T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。基于

9、圖1，本研究首先總結(jié)出影響每個因變量分子的生產(chǎn)和消耗函數(shù)的“正”“負(fù)”調(diào)控分子，然后依照范例所示建立其S-系統(tǒng)方程。 1.3 參數(shù)估計 除了定性的數(shù)據(jù)，目前還沒有文獻(xiàn)提供T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中各分子間相互作用的數(shù)量關(guān)系。另一方面，本研究并非旨在對該途徑的精確定量特征進(jìn)行模型研究，而只是試圖通過建立“數(shù)量級模型（order-of-magnitude model）”2來闡述模型結(jié)構(gòu)的整個動力學(xué)性質(zhì)，為從系統(tǒng)水平上進(jìn)一步理解T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑奠定基礎(chǔ)。因此，本研究采用前人總結(jié)的經(jīng)驗來估計每一過程的速率常數(shù)和動力學(xué)階的值。 實際上，對近年來的生化模擬系統(tǒng)所做的近1000次的動力學(xué)階的分析表明，未

10、受調(diào)節(jié)的過程其動力學(xué)階常位于1或0.5，而受調(diào)節(jié)的過程其動力學(xué)階通常要小一些。一般來說，“正”調(diào)控作用的動力學(xué)階常處于0和1之間，而“負(fù)”調(diào)控作用的動力學(xué)階常位于0和-0.5之間2。本研究對模型中未受調(diào)節(jié)的過程（一般為單變量）取動力學(xué)階為1；而對于受調(diào)節(jié)的過程（表現(xiàn)為多個變量），“正”調(diào)控作用則采用動力學(xué)階為0.5，“負(fù)”調(diào)控作用則采用動力學(xué)階為-0.5。 速率常數(shù)一般對模型結(jié)果不是那么敏感，其大小既與具體的反應(yīng)過程有關(guān)，也取決于時間單位2。由于本研究并非精確定量模型，故取各因變量分子的生產(chǎn)和消耗函數(shù)的速率常數(shù)為1。 各反應(yīng)分子的初始濃度的確定，本研究采用了“相對濃度”的概念，以避免濃度量綱對

11、模型分析的影響。所謂“相對濃度”，即是指某時刻反應(yīng)分子的濃度與其達(dá)到穩(wěn)態(tài)時的濃度的比值：相對濃度=瞬時濃度/穩(wěn)態(tài)濃度。文中各自變量，由于其為系統(tǒng)外輸入，啟動或控制系統(tǒng)動力學(xué)過程之變量，故保持其相對濃度始終為一常數(shù)值1；而對于各因變量，由于皆為信號級聯(lián)反應(yīng)過程的產(chǎn)物，故取其相對濃度的初始值為0或無窮?。ㄍǔＨ?.010-10以避免模型運(yùn)行中出現(xiàn)故障）。 1.4 模型運(yùn)行 通過科學(xué)計算軟件Matlab7.0的仿真平臺Simulink工具箱對已經(jīng)建立的T細(xì)胞受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的S-系統(tǒng)動力學(xué)方程進(jìn)行模型的搭建、調(diào)試和仿真運(yùn)行。仿真時間的設(shè)定以各因變量分子濃度達(dá)到其穩(wěn)態(tài)濃度為上限。值得注意的是，由于各因

12、變量分子濃度采用了“相對濃度”，無量綱，而且各因變量分子的生產(chǎn)和消耗函數(shù)的速率常數(shù)皆取值為1，因此仿真時間也只是一個相對概念，沒有量綱。對模型分別進(jìn)行兩方面的研究：模型基本特征的分析；模型的穩(wěn)定性分析。 2 結(jié)果 2.1 PLC-1介導(dǎo)的信號途徑 2.1.1 CD45 CD45為T細(xì)胞中蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPase）的一個典型代表。研究發(fā)現(xiàn)，CD45可調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化過程的一些起始關(guān)鍵酶如Lck、Fyn的活性。對于Lck，其催化區(qū)含有兩個可供調(diào)節(jié)的酪氨酸殘基（tyr394和tyr505），tyr394是一自身磷酸化位點(diǎn)，可通過自身磷酸化作用使Lck激酶活性上調(diào)；而tyr505的磷酸化則可使Lc

13、k激酶活性下調(diào)。當(dāng)TCR/CD3識別抗原后，已知兩種分子參與了tyr505的調(diào)節(jié)過程：CD4/CD8胞內(nèi)段具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性，可以通過介導(dǎo)tyr505的去磷酸化來提高Lck激酶活性；CD4/CD8和CD45發(fā)生共凝集，導(dǎo)致與CD4/CD8分子胞內(nèi)段相連的Lck的Tyr505位點(diǎn)受到CD45去磷酸化而被激活。同時，CD45也可能導(dǎo)致了與CD3相連的Fyn的酪氨酸殘基去磷酸化而被激活12。模型結(jié)果（圖3A）顯示，CD45經(jīng)細(xì)胞外分子激活后，活性濃度迅速上升，與共受體CD4/CD8一起通過去磷酸化激活Lck，同時也通過去磷酸化激活Fyn，導(dǎo)致Lck和Fyn的活性濃度迅速上升到高位，從而激活ZA

14、P-70的下游級聯(lián)。 2.1.2 ZAP-70 研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗原或抗體與TCR/CD3特異結(jié)合后，CD3分子胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸活化基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM）可被已活化的Src家族酪氨酸激酶Lck和Fyn磷酸化，成為SH2結(jié)構(gòu)域的高親和力結(jié)合位點(diǎn)，與含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白，如蛋白酪氨酸激酶ZAP-70相互結(jié)合。同時，由于與TCR/CD3緊鄰的CD4/CD8分子的胞漿部分與Lck相聯(lián)，因此Lck可就近使ZAP-70磷酸化促使其活化3，活化的ZAP-70可使含SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白LAT和SLP-76磷酸化4。

15、模型結(jié)果顯示（圖3AB），TCR/CD3在與抗原或抗體結(jié)合后，由于受到Lck和Fyn磷酸化激活，使得其活性濃度迅速升高，從而與ZAP-70相互結(jié)合，而結(jié)合后的ZAP-70隨即被Lck磷酸化而活化，活性濃度也隨即上調(diào)，ZAP-70進(jìn)而通過磷酸化而活化其下游分子LAT和SLP-76，導(dǎo)致LAT和SLP-76活性濃度也隨之上升。 2.1.3 SLP-76 SLP-76包括一個酸性的N末端區(qū)，該區(qū)包含三個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（Tyr-113，Tyr-128，Tyr-145）。磷酸化后，這些位點(diǎn)能結(jié)合VAV、NCK 和ITK的SH2區(qū)4。SLP-76中部含有脯氨酸富集區(qū)和精氨酸富集區(qū)，前者與PLC-1組成性

16、結(jié)合，后者與GRB2相關(guān)的下游接頭蛋白GADS關(guān)聯(lián)，從而形成SLP-76信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體4。模型結(jié)果也是如此（圖3AC），SLP-76活性濃度的上升導(dǎo)致其募集的分子（包括VAV、NCK、ITK、GADS和PLC-1）的濃度增加。 上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體中，ITK主要作用于：PLC-1的激活；響應(yīng)TCR刺激，通過激活VAV- Rho/Cdc42途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動蛋白重組5。而NCK 則通過激活PAK參與另外一條途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動蛋白重組5。模型結(jié)果顯示（圖3BC），活性上調(diào)的ITK通過磷酸化分別活化PLC-1和VAV，導(dǎo)致兩者活性濃度增加，而活化的VAV則促進(jìn)Rho/Cdc42活性上調(diào)；同樣，活性上調(diào)的NCK 則刺激PAK的活性濃度增加?；钚詽舛壬仙腞ho/Cdc42和PAK分別參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動蛋白的重組