凝膠滲透色譜凈化氣相色譜測(cè)定中成藥中有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留量

1、    凝膠滲透色譜凈化氣相色譜測(cè)定中成藥中有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留量作者：夏品華 張明時(shí) 陳文生 伍慶【摘要】  目的建立凝膠滲透色譜（GPC）凈化-毛細(xì)管氣相色譜測(cè)定中成藥中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量的方法。方法凝膠滲透色譜采用的流動(dòng)相為丙酮-環(huán)己烷 (14)，最佳流速是5 ml/min，最佳餾分收集時(shí)間是1526 min。結(jié)果低、中、高3個(gè)添加水平的回收率分別為85.5%115.0%，84.3%123.4%，86.7%114.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.1%9.3%，檢出限0.0080.05g/kg。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便，分離效果好，靈敏度高，重

2、現(xiàn)性好。 【關(guān)鍵詞】  氣相色譜 凝膠滲透色譜 有機(jī)氯農(nóng)藥 中成藥 殘留量有機(jī)氯類(lèi)農(nóng)藥(OCPs)是一類(lèi)高效廣譜殺蟲(chóng)劑，廣泛應(yīng)用于殺滅農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，曾是各國(guó)殺蟲(chóng)劑中使用最廣泛的一大類(lèi)。這類(lèi)農(nóng)藥化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，脂溶性強(qiáng)，殘效期長(zhǎng)，易在脂肪體內(nèi)蓄積，造成慢性中毒，嚴(yán)重危及人體健康，中藥材及中成藥的農(nóng)藥殘留問(wèn)題近年來(lái)逐漸引起人們的重視。盡快建立中藥中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法及限量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)保證人們用藥安全具有積極的意義。目前中藥材中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留測(cè)定主要采用有機(jī)溶劑提取，濃硫酸凈化，氣相色譜分析。但因中藥成分復(fù)雜，其中農(nóng)藥殘留量屬痕量范疇，這樣使得農(nóng)藥的提取、分離、凈化與富集的難度加大。凝膠滲

3、透色譜作為一種自動(dòng)化的分離技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中得到了推廣和應(yīng)用17。本研究運(yùn)用凝膠滲透色譜替代硫酸凈化，有效地克服了硫酸凈化回收率偏低的難題，建立的毛細(xì)管氣相色譜分析方法，具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快、分離效能高、檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合于中成藥中痕量有機(jī)氯農(nóng)藥的測(cè)定。  1 材料 Agilent 6890N 氣相色譜儀，配備捕獲檢測(cè)器（-ECD），安捷倫GC工作站。GPC純化系統(tǒng)：泵（Waters 515 HPLC Pump ），二極管陣列檢測(cè)器（Waters 2996 PAD）, 自動(dòng)餾分收集器（Waters Fraction Collector III），GPC純化柱（S

4、hodex CLNpak EV2000，20.0 mmID×300 mm），數(shù)據(jù)處理軟件（Waters Empower），5 ml定量環(huán)。OV-1701毛細(xì)管色譜柱30 m×0.32 mmID×0.32 m；R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI）； 電子 分析天平（R200D）。丙酮、環(huán)己烷均為色譜純（天津科密歐），二氯甲烷為分析純（天津科密歐）。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：甲體-六六六（- BHC）；乙體-六六六（- BHC）；丙體-六六六（- BHC）；丁體-六六六（- BHC）；對(duì)對(duì)位滴滴依（PP'-DDE）；鄰對(duì)位滴滴涕（OP-DDT）；對(duì)對(duì)位滴滴滴（PP'

5、-DDD）；對(duì)對(duì)位滴滴涕（PP'-DDT）；五氯硝基苯（PCNB）。所用標(biāo)準(zhǔn)品由 中國(guó) 成都化學(xué)試劑生產(chǎn)，純度大于99%。用甲醇分別配成0.1 mg/ml的單標(biāo)儲(chǔ)備液，再分別移取一定量的單標(biāo)儲(chǔ)備液于10 ml容量瓶中，用丙酮-環(huán)己烷（14）混合液定容，配成混合標(biāo)準(zhǔn)液。  2 方法 2.1 樣品的提取 準(zhǔn)確稱取仙靈骨葆膠囊樣品（膠囊直接取其粉末即可，顆粒須經(jīng)磨碎成粉末） 2.5 g于具塞錐形瓶中，加入10 ml水浸泡過(guò)夜或超聲30 min，加丙酮30 ml超聲30 min，加3 g氯化鈉，振搖，再加30 ml二氯甲烷，超聲30 min，靜置12 h，取30 min上清

6、液于100 ml濃縮瓶中，在50旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮近干，再加丙酮-環(huán)己烷（14）混合液5 ml，重復(fù)2次，用丙酮環(huán)己烷混合液定容至10 ml，4 000 r/min離心10 min待用。2.2 GPC凝膠凈化實(shí)驗(yàn)2.2.1 GPC洗脫 規(guī)律 實(shí)驗(yàn)取5 ml一定濃度的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣，用Waters 2996 PAD進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以丙酮環(huán)己烷（14）混合液作流動(dòng)相， 流量5 ml/ min，每毫升收集于一個(gè)試管中，收集30個(gè)，用氮吹近干，丙酮環(huán)己烷定容至1 ml得到待測(cè)液1。同樣在做成藥洗脫曲線時(shí)，用帶0.45 l尼龍微孔濾膜的10 ml的注射器取樣品提取液5 ml過(guò)GPC，其余同上，得到待測(cè)液2

7、。2.2.2 GPC凈化取“2.1”項(xiàng)的提取液5.0 ml進(jìn)樣到GPC；保持流速為5 ml/ min，收集第1526 min餾分。濃縮淋洗液,用丙酮環(huán)己烷定容至5 ml待測(cè)，得到待測(cè)液3。2.3 GC分析條件Agilent 6890N 氣相色譜儀，配備捕獲檢測(cè)器（-ECD），ov-1701彈性石英毛細(xì)管色譜柱30 m×0.32 mmID×0.32 m；進(jìn)樣口280，柱溫220，檢測(cè)器370，載氣為高純N2（純度99.99%），柱前壓105 KPa，柱流量1.5 ml/min，進(jìn)樣量1 l，不分流進(jìn)樣。  3 結(jié)果 3.1 凈化條件的確定餾分收集時(shí)間點(diǎn)的確

8、定要充分考慮被滲透排除的機(jī)體組分與混合標(biāo)準(zhǔn)組分的分離情況和回收率。成藥樣品和農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)GPC凈化后GC-ECD檢測(cè)結(jié)果表明，收集第1526 min的餾分，成藥（仙靈骨葆膠囊，貴州同濟(jì)堂制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)）樣品凈化率可達(dá)70%，加標(biāo)回收率為85%115%，回收率滿足痕量分析的要求，成藥樣品色譜圖見(jiàn)圖1。3.506 min為- BHC，3.77 min為PCNB，5.94 min為- BHC圖1 成藥樣品GC-ECD色譜圖3.2 成藥及9種有機(jī)氯農(nóng)藥的GPC流出 規(guī)律 GPC是根據(jù)多孔凝膠對(duì)不同大小分子的排阻效應(yīng)進(jìn)行分離，大分子的油脂、色素(葉綠素、葉黃素)、生物堿、聚合物等先淋洗出來(lái)，農(nóng)藥

9、及 工業(yè) 污染物等分子量較小，后淋洗出。GPC凝膠柱對(duì)成藥以及9種有機(jī)氯農(nóng)藥的分離、凈化效果進(jìn)行如下試驗(yàn)。將待測(cè)液1分別用Agilent 6890N 氣相色譜儀， 電子 捕獲檢測(cè)器（-ECD）檢測(cè)出各段流出農(nóng)藥的含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。9種有機(jī)氯農(nóng)藥在凝膠滲透色譜柱上都是在第1526 min時(shí)流出，但在第15 min僅有- BHC和第26 min有PCNB流出少量，所以，在樣品基質(zhì)較復(fù)雜的體系中，只需收集1625 min，這可最大限度去除油脂等雜質(zhì)的干擾，回收率達(dá)到85%115%。將待測(cè)液2分別用Agilent 6890N 氣相色譜儀，電子捕獲檢測(cè)器（-ECD）檢測(cè)出各段流出液雜質(zhì)的含量，結(jié)果見(jiàn)圖3

10、。成藥流出液雜質(zhì)（油脂、色素、生物堿等）在凝膠滲透色譜柱上是在第1035 min流出，其中1015 min時(shí)流出 50%的雜質(zhì)，第15分鐘收集的餾分在ECD上響應(yīng)值最高，第900分收集的餾分在ECD上有響應(yīng)。圖2 9種有機(jī)氯農(nóng)藥的GPC流出規(guī)律 圖3 仙靈骨葆膠囊的GPC流出規(guī)律3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和方法學(xué)評(píng)價(jià)配制5個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)3次，取峰面積平均值，得線性回歸方程，見(jiàn)表1。有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖4。從表1得出，在一定的濃度范圍內(nèi)，9種有機(jī)氯農(nóng)藥的線性關(guān)系良好，線性關(guān)系系數(shù)r（0.998 90.999 7）。加標(biāo)樣品按3倍基線-噪聲比 計(jì)算 9種有機(jī)氯農(nóng)藥的檢出限。

11、3.4 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)在2.5 g成藥樣品中加入3種不同濃度（添加水平見(jiàn)表2）有機(jī)氯混合標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法進(jìn)行，同時(shí)做空白對(duì)照，回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見(jiàn)表2，成藥加標(biāo)GC-ECD色譜圖見(jiàn)圖5。 表2 回收率與精密度測(cè)定結(jié)果3.5 樣品測(cè)定按照本文建立的方法，測(cè)定了貴州省出口潛力較大的3種中成藥，農(nóng)藥殘留測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，貴州中藥有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留自實(shí)行中藥藥材規(guī)范化種植以來(lái)，中藥中有機(jī)氯農(nóng)藥污染已得到了控制。表3 3種成藥中有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留量mg·kg-1 H1-仙靈骨葆膠囊（批號(hào)：060428），貴州同濟(jì)堂制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)；H2-抗婦炎膠囊，貴州遠(yuǎn)程制藥有限責(zé)任有限

12、公司生產(chǎn)（批號(hào)：Z20025698）；H3-婦科再造丸（批號(hào)：Z20025056），貴州德昌祥藥業(yè)有限公司生產(chǎn)?！?”表示未檢出4 討論 本文以貴州出口中成藥仙靈骨葆膠囊為樣品，系統(tǒng)地研究了其提取液和有機(jī)氯農(nóng)藥的GPC流出規(guī)律，建立了仙靈骨葆膠囊中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法，并成功地運(yùn)用于其他中藥的測(cè)定。建立的GPC凈化，氣相色譜測(cè)定中成藥中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量的方法具有自動(dòng)化程度高，回收率和凈化效率好等優(yōu)點(diǎn)，適合于大部分中成藥中9種有機(jī)氯農(nóng)藥的測(cè)定。但對(duì)于含糖組分較高的中成藥，如糖漿類(lèi)成藥，本文建立的樣品提取方法不適用，有待進(jìn)一步研究?！?參考  文獻(xiàn) 】 1 劉詠梅，王志華，儲(chǔ)曉剛. 凝膠滲透色譜技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用J.分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2005, 24(2)：123.2 劉詠梅, 王志華, 儲(chǔ)曉剛. 凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜分離同時(shí)測(cè)定糙米中50種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留J.分析化學(xué)，2005，33(6)：808.3 李 櫻，儲(chǔ)曉剛，仲維科，等.凝膠滲透色譜氣相色譜同時(shí)測(cè)定糙米中擬除蟲(chóng)菊酯有機(jī)氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯的殘留量J.色譜，2004，22（5）：551.4 曾凡剛.凝膠滲透色譜凈化：氣相色譜法測(cè)定牛奶中10種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留J. 中國(guó) 乳品工業(yè)，2006，34（5）：52.5 高夢(mèng)南，王燕萍，唐紅衛(wèi)，等.凝膠滲透色譜凈化